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《苏州大学》 2017年
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蜕皮激素和保幼激素对家蚕丝蛋白基因表达的影响

赵晓明  
【摘要】:蜕皮激素(Ecdysone,20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile Hormone,JH)可以调控昆虫的生长发育,家蚕丝腺的生长发育及丝蛋白的合成也受到20E和JH的调节。为了研究20E和JH对家蚕丝蛋白基因表达的调控作用,本文检测分析了三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”丝蛋白基因表达水平的差异;离体培养家蚕丝腺,分析其在激素诱导下丝蛋白基因的表达水平;并分析了丝素基因5’侧翼区中与激素诱导相关的重要区域。结果如下:1三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”丝蛋白基因的表达水平分析1.1三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”ser-1基因的表达趋势均表现为龄初快速上升然后下降。其中三眠蚕“三光”4龄期ser-1基因的表达量最高上调了3.0倍,四眠蚕“皓月”4龄期ser-1基因的表达量最高上调了1.5倍,5龄期最高上调了2.8倍,其中三眠蚕4龄期ser-1基因的表达水平上调倍数最高。1.2三眠蚕“三光”与四眠蚕“皓月”丝素基因的表达均表现出从起蚕开始直线上升的趋势。三眠蚕“三光”4龄期fib-H、fib-L和p25基因的表达量最高分别上调了2.8倍,2.9倍,5.2倍。四眠蚕“皓月”4龄期fib-H、fib-L和p25基因的表达量最高分别上调了1.4倍、1.4倍、2.2倍;5龄期最高分别上调了4.5倍、6.2倍、24.3倍。其中四眠蚕“皓月”5龄期丝素基因上调倍数最高,其次是三眠蚕“三光”4龄期。1.3无论是三眠蚕“三光”4龄期还是四眠蚕“皓月”4龄期、5龄期丝素基因的表达量高低依次为:p25、fib-H、fib-L;表达量上调倍数高低依次为:p25、fib-L、fib-H。2激素处理体外培养丝腺丝蛋白基因的早期(0-24h)表达分析2.1 20E处理对丝蛋白基因表达的早期影响20E单独处理时,中浓度20E处理组对ser-1基因的表达水平有促进作用并在12h最为显著;不同浓度20E处理均抑制了fib-H基因的表达水平;对于fib-L基因的表达,高浓度20E处理具有促进作用;不同浓度20E处理均能促进p25基因的表达,且中、高浓度效果更为显著。2.2 JHⅢ处理对丝蛋白基因表达的早期影响JHⅢ单独处理对丝蛋白基因的表达以抑制作用为主。其中只有低浓度JHⅢ处理对ser-1基因的表达在早期有促进作用,其余浓度对ser-1基因的表达起抑制作用;不同浓度JHⅢ处理对fib-H、fib-L和p25基因的表达均有抑制作用。2.3 20E和JHⅢ共同处理对丝蛋白基因表达的早期影响一般情况下,20E和JHⅢ共同处理比单种激素处理更有利于丝蛋白基因的表达,但特定的浓度比例促进作用更为明显。低浓度20E+中浓度JHⅢ处理组对3种丝素基因的表达均有促进作用;中浓度20E+中浓度JHⅢ处理组对ser-1基因和p25基因的表达起促进作用;中浓度20E+低浓度JHⅢ处理组促进ser-1基因和fib-H基因的表达。在某些特殊情况下,例如,JHⅢ浓度太低时,共同处理不但对丝蛋白基因的表达无促进作用,反而严重抑制了fib-L和p25基因的表达。3.激素诱导后家蚕丝素基因启动子活性分析实验结果表明,在本实验所用Bmfib-H、Bmfib-L基因5’侧翼区全长(Bmfib-H全长+36~-1164 bp;Bmfib-L全长+15~-1061 bp)及不同短截片段中,20E、JHⅢ单独处理以及20E和JHⅢ共同处理均不同程度抑制了Bmfib-H、Bmfib-L基因各启动子片段的活性,且与对照相比均未发现活性上调的片段。20E、JHⅢ单独处理以及20E和JHⅢ共同处理显著抑制Bmp25基因启动子-1342~-1032 bp片段的活性,却显著上调-743~-662 bp片段的活性,表明Bmp25基因启动子-1342~-1032 bp之间可能存在与20E或JHⅢ诱导相关的抑制区域;而-743~-662bp之间可能存在促进激素诱导作用的区域或转录因子,进一步的基因启动子突变结果表明,GA-BF和HNF-1A转录结合位点是激素促进Bmp25启动子-743~+38 bp区域活性所必需的。总之,在本研究中,通过比较分析三眠蚕“三光”和四眠蚕“皓月”丝蛋白基因的表达水平,发现丝蛋白基因的表达水平在四龄或五龄前期20E和JH均处于极低水平的情况下即快速上升,在龄中后期随着20E和JH滴度上调,ser-1基因的表达下降,而丝素基因的表达水平继续上升达到最高,表明在个体体内,20E和JH对丝蛋白基因表达的影响较为复杂,有待于今后深入地研究;通过分析激素诱导体外培养丝腺中丝蛋白基因的表达水平,发现20E和JHⅢ共同处理比激素单独处理更有利于丝蛋白基因的表达,但共同处理组JHⅢ浓度过低会抑制fib-L和p25基因的表达;此外,通过分析激素诱导后Bmp25基因启动子的活性,发现GA-BF和HNF-1a转录结合位点是激素促进Bmp25启动子-743~+38 bp区域活性所必需的。这些结果为今后研究家蚕丝蛋白基因的激素调控提供理论参考。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S881.2

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