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《苏州大学》 2017年
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野桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpins基因的克隆、表达及PPO活性分析

毛钰霞  
【摘要】:Serpin和PPO参与调节生物体内众多生理反应。为研究野桑蚕和家蚕serpins的表达及PPO的活性,本文在以下方面做了研究:克隆了野桑蚕serpin-1、serpin-2、serpin-3、serpin-4、serpin-5和serpin-6这6个基因,并经测序后分析其基因序列;分析比较家蚕和野桑蚕不同发育时期、不同组织中serpins的转录水平;分析比较家蚕和野桑蚕不同发育时期、不同组织中的PPO活性。结果如下:1野桑蚕serpins基因的克隆和分析以野桑蚕幼虫全组织cDNA为模板,经克隆、测序成功获得了野桑蚕serpins基因的开放阅读框(ORF)序列,GenBank登录号分别为:KR003729,KR003725,KR003726,KR003727,KR003728,KR003730。野桑蚕serpins基因的ORF序列长1137~1371 bp,编码378~458个氨基酸,蛋白分子量42~51 kDa,等电点在4.65~7.32之间。经与家蚕serpins比对发现,野桑蚕与家蚕serpins核苷酸序列的同源性很高,其中serpin-3的同源性最高,为99.27%;最低的serpin-6其同源性也达到了97.83%。基因结构分析显示,家蚕和野桑蚕在相同位置均有一个典型的SERPIN结构域,其中的活性中心环(reactive centre loop,RCL)位于C末端,其序列具有很高的保守性,另外断裂位点(the reactive center site,P1)位点相同。聚类分析显示,野桑蚕与家蚕serpins的关系最近,表明serpin在进化过程中保守性较好。2家蚕和野桑蚕serpins基因转录特异性分析采用荧光定量PCR研究了家蚕(4龄末至游走期)、野桑蚕(5龄期间)脂肪体和体壁的转录特征。结果表明:家蚕脂肪体serpin-1、2、4、5、6的转录水平以五龄中期及游走期较高,serpin-3则是在初期较高。家蚕体壁serpin-1、2、4、5的转录水平以五龄中后期较高,serpin-3和serpin-6则是在游走期较高。野桑蚕脂肪体和体壁serpins的转录水平均是五龄初期高于中期和后期。比较五龄期间家蚕、野桑蚕serpins的表达水平,野桑蚕脂肪体serpins的转录水平均低于家蚕脂肪体serpins;野桑蚕体壁serpins的转录水平在五龄初期高于家蚕;而在五龄中后期,野桑蚕体壁serpins的转录水平均低于家蚕。以上结果表明家蚕和野桑蚕serpins的转录水平时间、空间特异性并不相同。3家蚕和野桑蚕PPO活性差异比较选取菁松、黒缟、大造和野桑蚕,测定其在不同发育时期、不同组织中PPO的活性。结果表明:菁松血淋巴PPO活性是五龄中期高于其他发育阶段;体壁PPO活性也是五龄中期高于其他发育阶段。黒缟血淋巴PPO活性是五龄初期高于其他发育阶段;体壁PPO活性则是五龄中期高于其他发育阶段。大造血淋巴PPO活性是五龄初期高于其他发育阶段;体壁PPO活性则是五龄中期高于其他发育阶段。野桑蚕血淋巴PPO活性是五龄中期高于其他发育阶段;体壁PPO活性则是五龄末期高于其他发育阶段。血淋巴PPO活性高低依次为菁松、黒缟、大造、野桑蚕,体壁中PPO活性高低依次为大造、黒缟、菁松、野桑蚕。不论是血淋巴还是体壁,野桑蚕PPO活性均低于家蚕。家蚕中,菁松血淋巴PPO活性高,而体壁PPO活性较低;与之相反,大造血淋巴PPO活性低,而体壁PPO活性高;黒缟这一现象不显著。以上结果表明野桑蚕血淋巴和体壁中的先天免疫均低于家蚕。本研究克隆野桑蚕serpins基因并分析其序列,比较了家蚕和野桑蚕sȍ2*].PEȍ2*].织特异性,这些研究工作为家蚕、野桑蚕serpin的研究提供了理论基础。本文同时还比较了家蚕和野桑蚕不同组织中PPO的活性,其结果对理清家蚕起源中的一些关键问题具有一定的参考意义。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S881.2

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