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《苏州大学》 2017年
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家蚕BmArrestin2基因功能研究

梁子  
【摘要】:β-arrestin2是一种广泛分布的蛋白,在哺乳动物中,它对G蛋白偶联受体介导的信号转导具有重要调节作用。β-arrestin2在进化上高度保守,从果蝇到小鼠到人都发现了β-arrestin2的同源基因。有关哺乳动物的β-arrestin2研究已经比较深入,但是在家蚕这一鳞翅目昆虫模式种中,β-arrestin2的功能至今还没有报道过。本研究在成功克隆BmArrestin2的基础上,检测了该基因在家蚕不同组织、不同龄期的表达水平,筛查了BmArrestin2的相互作用蛋白,研究了调节BmArrestin2表达对家蚕部分信号通路关键基因的影响,探讨了BmArrestin2对培养细胞大小、周期、凋亡以及细胞对病毒感染的影响。研究结果为理解BmArrestin2的功能提供了新的线索。1.BmArrestin2的表达模式分析、亚细胞定位及其相互作用蛋白的筛选利用荧光定量PCR分析BmArrestin2的表达模式,结果显示BmArrestin2在五龄三天卵巢中的表达量最高;进一步分析BmArrestin2在五龄三天家蚕不同组织中转录水平的结果显示,气管丛中BmArrestin2 mRNA的丰度最高,其次是血细胞,在中肠和表皮中也有表达,在精巢中表达量最低。利用重组BmArrestin2免疫小鼠,制备了BmArrestin2蛋白的抗体。免疫荧光结果显示,BmArrestin2主要分布在卵巢来源的BmN细胞的细胞质中。采用免疫共沉淀技术筛选BmArrestin2与家蚕BmN细胞的相互作用蛋白,质谱鉴定结果暗示Actin、Yorkie3(Yki3)可能是BmArrestin2的相互作用蛋白。2.调节BmArrestin2表达对家蚕部分信号通路关键基因的影响为了探讨BmArrestin2的功能,通过定量PCR研究了过表达BmArrestin2以及下调BmArrestin2对家蚕部分信号通路中一些关键基因表达水平的影响。结果显示,当BmArrestin2过表达时,Hippo通路中kibra、ex表达水平上调;wts、Bmpr表达水平无明显变化;wnt、yki、cyce、iap、Fj、dpp、serr、myc、crb表达水平下调。在生长相关通路基因中,GASP、NkAB、DYNE、PSLR表达水平上调;JH、PCL、LSAM表达量无明显变化;而ECDY、CFAP、LACH、UMX表达水平下调。在天然免疫及凋亡相关通路中,STAT、Tal、SPZ、APA、PGRP-LB、PGRP-LE表达水平下调;SURF、QCTY表达水平无明显变化。当通过RNAi下调BmArrestin2时,所测基因的表达水平变化总体上与过表达BmArrestin2时结果相反。流式细胞仪检测结果显示,BmArrestin2能够抑制细胞周期,减小细胞体积,对细胞的凋亡影响不明显,表明BmArrestin2对Hippo信号通路、细胞周期通路,天然免疫信号通路有调节作用。3.BmArrestin2对病毒感染细胞的影响为了进一步鉴定BmArrestin2的功能,研究了BmArrestin2对病毒感染细胞的影响。结果显示,过表达BmArrestin2的细胞对BmNPV、BmCPV的感染性都增强;抗体封闭内源性BmArrestin2可降低病毒对细胞的感染能力;病毒感染可引起内源性BmArrestin2的表达水平降低。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S881.2

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