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《苏州大学》 2017年
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miR-148b通过下调Sirtuin7抑制黑色素瘤恶性生物学行为

孙睿  
【摘要】:【目的】:本研究将探究miR-148b对黑色素瘤恶性生物学行为的抑制作用及机制,为miR-148b成为黑色素瘤预后判断及治疗靶点奠定理论基础。【方法】:1、组织样本和细胞的准备,共收集黑色素瘤石蜡切片样本30例,皮肤良性肿瘤石蜡片8例。3个黑色素瘤细胞株,1株原代人黑色素细胞系。2、生物信息学分析研究,Target Scan预测mi R-148b的直接靶基因,SIRT7。3、利用实时荧光定量PCR技术,检测miR-148b在三株黑色素瘤细胞、人黑色素细胞的差异性表达。4、荧光原位杂交技术检测miR-148b在黑色素瘤组织及皮肤良性肿瘤组织石蜡切片中差异性表达。5、免疫荧光检测SIRT7在黑色素瘤组织及皮肤良性肿瘤组织中的表达差异及分布模式。6、SIRT7野生型及突变型质粒构建、miR-148b慢病毒包装和转染,miR-148b模拟物、抑制物及无义序列的合成。7、实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹法、双荧光素酶报告基因实验进行靶基因验证。8、观察miR-148b过表达后细胞表型的变化,即进行划痕、侵袭迁移、增殖及克隆形成细胞功能学实验。9、统计学分析。【结果】:1、实时荧光定量PCR实验证实miR-148b在黑色素瘤细胞的表达明显低于人表皮黑色细胞。2、荧光原位杂交结果证实miR-148b在黑色素瘤组织中表达水平显著低于皮肤良性肿组织。3、免疫荧光结果证实黑色素瘤组织中SIRT7染色强度明显高于皮肤良性肿瘤组织,主要分布于细胞核中,部分于胞浆中表达。4、双荧光素酶报告基因实验结果显示:miR-148b通过结合SIRT7基因的3’UTR区抑制SIRT7的表达,SIRT7是miR-148b的直接靶基因。5、Western blot结果显示miR-148b mimic的过表达能显著抑制SIRT7的蛋白水平表达。实时荧光定量PCR结果证实在mRNA水平上,转染miR-148b-mimic显著抑制了SIRT7的转录。6、侵袭、划痕、增殖及克隆形成实验证实miR-148b过表达能显著抑制黑色素瘤细胞侵袭、迁移、增殖及克隆形成能力。【结论】:1、实时荧光定量PCR结果证实miR-148b在黑色素瘤细胞的表达显著低于人表皮黑色素细胞。荧光原位杂交结果证实:与良性皮肤肿瘤相比,黑色素瘤组织中miR-148b表达水平明显下调。免疫荧光结果证实:与良性皮肤肿瘤组织相比,黑色素瘤组织中SIRT7表达水平明显上调。即miR-148b在黑色素瘤中扮演者抑癌因子的角色,可能与SIRT7在黑色素瘤中的表达负相关。2、SIRT7是miR-148b的直接靶基因,是肿瘤分子生物学机制研究的焦点之一,充分的实验证实miR-148b过表达能抑制SIRT7的表达水平,说明miR-148b可能通过调控SIRT7影响黑色素瘤的恶性生物学行为。3、miR-148b在黑色素瘤细胞中的稳定过表达能有效抑制其恶性生物学行为。过表达miR-148b能降低细胞的增殖、侵袭迁移及克隆形成能力。有望成为黑色素瘤基因治疗的有效分子。综上所述,SIRT7是miR-148b的直接靶基因,充分的实验证实miR-148b过表达能抑制SIRT7转录及翻译水平的表达既而抑制黑色素瘤恶性生物学行为,所以miR-148b及SIRT7有望作为黑色素瘤早期诊断、预后判断和分子治疗的新靶点。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R739.5

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