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《苏州大学》 2016年
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邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对生长期小鼠体液免疫应答的影响及其机制研究

韩毓  
【摘要】:邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是一种产耗量大、应用广泛、危害性强的邻苯二甲酸酯类化合物,它已经成为全球范围内备受关注的环境持久性有机污染物。人类可以通过饮食饮水、空气尘埃、皮肤吸收和医疗暴露等多种途径接触到DEHP,其中经消化道暴露是主要方式,并且儿童表现出对DEHP更高的易感性。流行病学调查资料提示长期DEHP暴露与现阶段支气管哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎等疾病在遗传背景相对稳定的同一地区人群尤其是儿童中持续高发密切相关。已知体液免疫失调是这类IgE介导的过敏性疾病的致病基础。滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell,Tfh)是新近确认的辅助B细胞介导体液免疫应答的重要Th细胞亚群,其分化紊乱和功能异常会破坏机体内环境的免疫平衡。Tfh细胞可以通过自身表达的免疫调节受体来应对外界刺激。细胞核表面或细胞浆内的过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-actived receptor-γ,PPAR-γ)能够与相应配体发生选择性结合,继而进入细胞核对下游靶基因的转录和表达进行调控。已有研究表明DEHP亦是一种核激素受体调节因子,其在体内的代谢产物可与PPAR-γ识别结合并相互作用,由此介导产生全身或局部毒效应。鉴于此,我们着眼于Tfh细胞这个新的切入点,探讨环境污染物DEHP对生长期小鼠体液免疫应答的影响及其具体作用机制。实验方法设计如下:(1)选择初断乳BALB/c小鼠作为研究对象,给予动物经口灌胃低、中、高剂量的DEHP溶液,同时经足垫皮下注射OVA致敏,建立生长期小鼠DEHP消化道暴露模型,采用ELISA法检测血清中OVA特异性IgE和IgG1类抗体的分泌量,免疫荧光组织化学法观察淋巴小结生发中心的形成,流式细胞术分析外周淋巴器官Tfh细胞和浆细胞的分化数量。(2)依次将DEHP暴露和正常小鼠Tfh细胞或非Tfh细胞与B细胞进行T、B细胞两两混合,经尾静脉注射过继性输入先天性T、B淋巴细胞数量与功能明显缺陷的SCID小鼠体内,OVA致敏后采用ELISA法检测血清中OVA特异性Ig E和IgG1类抗体的分泌量。随后,进一步分析DEHP灌胃染毒对生长期BALB/c小鼠外周淋巴器官Tfh细胞核受体PPAR-γ表达、转录因子调控与细胞因子分泌功能的影响,采用实时定量RT-PCR与Western Blot检测Tfh细胞核受体PPAR-γ、特定核转录因子Bcl-6和c-Maf的表达水平,流式细胞术分析Tfh细胞核转录因子表达以及胞内细胞因子IL-21和IL-4的合成水平。(3)针对Tfh细胞建立DEHP体外暴露联合干预模型,分析在阻断或激动PPAR-γ时,DEHP对Tfh细胞转录因子调控、表面分子表达以及细胞因子分泌功能的影响,采用实时定量RT-PCR与Western Blot检测Tfh细胞特定核转录因子Bcl-6和c-Maf的表达水平,流式细胞术分析Tfh细胞膜表面标志物与核转录因子的表达水平,ELISA法检测Tfh细胞培养上清液中特征性细胞因子IL-21和IL-4的分泌量。实验结果显示:(1)DEHP胃肠道暴露能够以类似佐剂样毒性作用促进OVA致敏的生长期小鼠血清中特异性IgE和IgG1类抗体分泌增多,外周淋巴器官生发中心扩增,其内CD4~+CXCR5~+ICOS~+/CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh细胞和CD19~+CD138~+GL-7~+浆细胞分化增加。(2)正常小鼠Tfh细胞与B细胞混合过继输注重建了基础水平特异性IgE和IgG1类抗体的诱导产生;且DEHP暴露小鼠Tfh细胞无论是与正常小鼠或DEHP暴露小鼠B细胞混合过继性输入时,都能促进受体小鼠血清中OVA特异性IgE和IgG1分泌升高;而DEHP暴露小鼠B细胞与正常小鼠Tfh细胞混合过继输注则不能提高抗体含量。DEHP胃肠道暴露能够以佐剂样作用促进OVA致敏原诱导生长期小鼠外周淋巴器官Tfh细胞的核受体PPAR-γ以及特定核转录因子Bcl-6和c-Maf表达增加,胞内细胞因子IL-21和IL-4合成增多。(3)DEHP体外暴露能够上调Tfh细胞相关分子包括核转录因子、膜表面标志物以及细胞因子的表达水平;当在DEHP暴露组的培养体系中加入PPAR-γ阻断剂时,Tfh细胞转录因子Bcl-6和c-Maf以及表面分子CXCR5、ICOS和PD-1表达降低,细胞因子IL-21和IL-4分泌减少;当添加PPAR-γ激动剂时,Tfh细胞转录因子Bcl-6和c-Maf表达量以及细胞因子IL-4分泌量进一步升高。综上所述,我们可以得出以下结论:(1)DEHP胃肠道暴露能够以类似佐剂样毒性作用引起OVA致敏的生长期小鼠体液免疫应答失调,促进生发中心扩增、浆细胞分化增加以及速发型超敏反应相关抗体产生增多。(2)DEHP对OVA致敏小鼠体液免疫应答的干扰作用直接起因于Tfh细胞。DEHP胃肠道暴露能以佐剂样作用促进致敏原诱导生长期小鼠外周淋巴器官中初始Th细胞向Tfh细胞分化过度,Tfh细胞转录调控和细胞因子分泌功能紊乱,其辅助B细胞介导的体液免疫应答失调。(3)Tfh细胞中PPAR-γ可能是DEHP体内代谢产物靶向作用的核受体分子,并且参与调控Tfh细胞的分化和功能。DEHP代谢产物可与Tfh细胞核受体PPAR-γ选择性结合,影响PPAR-γ对下游靶基因的转录调控,造成Tfh细胞转录因子、表面分子及细胞因子的表达异常。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R114

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