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《苏州大学》 2018年
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产丙酮酸棒状杆菌抗MRSA感染作用的机制研究

章杨  
【摘要】:目的:通过体内实验研究产丙酮酸棒状杆菌(Corynebacterium pyruviciproducens,C.pyruviciproducens,CP)及其细胞壁成分肽聚糖(CP-PGN)对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的抗感染作用;再通过体外细胞实验来寻找产丙酮酸棒状杆菌发挥免疫佐剂功能的调节途径和有效成分。方法:(1)采用三氯乙酸法提取产丙酮酸棒状杆菌的细胞壁成分-肽聚糖,并通过溶菌酶溶解实验对提取的肽聚糖进行纯度验证。同时分析该肽聚糖的结构、氨基酸的种类及含量。(2)建立小鼠感染模型和治疗模型,观察小鼠生存状态并记录生存和死亡时间,濒临死亡时眼球取血,同时获取肝和肺组织,检测外周血和重要脏器的细菌载量,通过测量脾脏大小重量、肺组织病理切片、血常规分析、实时荧光定量PCR法检测小鼠全血中IL-6和TNF-α来研究产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖能否提高小鼠抗感染能力。(3)通过RAW264.7细胞与MRSA共培养,显微镜计数染色后的细胞来研究产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖能否增加细胞对MRSA的吞噬率。(4)Griess分析法检测NO含量,Transwell实验观察迁移率,实时荧光定量PCR法检测细胞中TNF-α,IL-12,IL-10表达水平,从而探讨产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖对RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞活化的影响。(5)实时荧光定量PCR法检测i NOS和Arginase-1,流式细胞分析技术检测CD86百分率的变化,从而衡量产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖对巨噬细胞分化的影响。(6)RAW264.7细胞电转TLR2-si RNA后,通过实时荧光定量PCR法、Griess分析NO、细胞迁移分析以及流式细胞分析技术来研究TLR2干扰后,产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖对RAW264.7细胞活化和分化的影响。结果:(1)通过溶菌酶溶解实验验证可知,所提取的产物为肽聚糖。产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的分子量为18774Da,红外光谱分析具有肽聚糖的特征峰,国标法GB/T14965-1994检测出了其氨基酸的种类及含量。(2)CP及CP-PGN对MRSA引起的血流感染具有显著预防和治疗作用。(3)CP及CP-PGN促进了巨噬细胞的吞噬杀菌能力、趋化迁移能力和细胞因子的合成,表明CP及CP-PGN能够有效激活巨噬细胞的免疫功能。(4)通过q RT-PCR和流式细胞分析技术的结果可以看出,产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖能够诱导巨噬细胞朝M1型分化。(5)采用si RNA沉默TLR2的表达后,与未干扰组相比,相关指标明显下降,表明TLR2的沉默能够下调产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖对巨噬细胞的活化和分化。结论:通过相关细胞和动物实验发现,产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖能够通过TLR2途径有效活化巨噬细胞并促进M1方向的分化,对MRSA引起的感染具有显著的防治作用。经进一步系统研究后,产丙酮酸棒状杆菌及其肽聚糖有望成为一种有效的免疫调节剂,为老年人、慢性病病人和免疫功能低下的人群,提供一种抗感染辅助治疗和预防的不错的选择。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R378

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【参考文献】
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