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《苏州大学》 2018年
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BmCPV circRNAs功能及过表达BmCPV单基因对病毒增殖的影响

黄立旭  
【摘要】:随着高通量测序技术和生物信息学的进步,越来越多的circRNAs(circular RNAs)被发现。并已证实一些circRNAs具有结合miRNAs、与RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)互作、参与基因转录、剪接调控等多种多样的功能,并在细胞增殖、分化、存活、衰老等许多生命过程和多种疾病的发生中发挥重要作用。家蚕细胞质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)是CPV1型的典型种,能感染家蚕中肠细胞,导致家蚕发生质型多角体病引起养蚕歉收。病毒作为生物体的一大类,是人类、动物和植物重要疾病的病原,但至今没有病毒的转录产物形成circRNAs的有关报道。本研究中,通过高通量测序在BmCPV感染的家蚕中肠组织中发现有295种BmCPV来源的circRNAs。这些circRNAs分子大小分布在100-3800 nt,主要集中在200-1000 nt。circRNAs来源上在Bm CPV基因组的10个片段都有分布,但主要分布在基因组正链上。在对BmCPV circRNAs连接位点两侧的剪接信号进行统计后发现,病毒circRNAs的形成并不遵循典型的GT-AG拼接规则,并且在基因组正负链上也各不相同。GO和KEGG分析显示,BmCPV circRNAs可能通过与miRNA互作,调节细胞的蛙皮素受体信号通路、果糖2,6-二磷酸代谢过程、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路等。通过PCR产物测序、Northern blot进一步确认了BmCPV感染的家蚕中肠组织中存在BmCPV病毒来源的circRNAs。另外,本研究还发现在过表达BmCPV单基因的转化细胞系、BmCPV病毒粒子中都检测到病毒来源的circRNAs。这些新发现证明,BmCPV通过反向剪接形成功能性circRNA,为理解病毒基因的转录调节、病毒与宿主的互作提供了新的视角。为了更好地阐释病毒产生circRNAs的功能及作用机制,又对Bm CPV circ_048开展了更进一步的研究。qPCR检测发现circ_048是在BmCPV感染BmN细胞12小时后开始形成,并逐步累积。细胞免疫荧光结果显示,circ_048定位在BmN细胞质中。转染实验结果显示,上调circ_048水平可抑制Bm CPV的增殖,同时还上调了家蚕先天免疫相关基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白质磷酸酶的表达水平。另外,通过RNA pull down与质谱鉴定发现,circ_048有可能与Elongation factor 1-alpha、ATP synthase subunit beta等蛋白互作。信息学分析显示,circ_048具有IRES序列,具有编码6种多肽ORF-V,ORF-1,ORF-2,ORF-3,ORF-4和ORF-5的可能。进一步人工合成上述多肽的抗原肽、制备混合抗体,细胞免疫荧光实验结果显示,circ_048可能具有编码多肽的潜能。同时,还发现ORF-3、ORF-5起源的抗原肽都能够抑制BmCPV病毒的增殖,ORF-5起源的抗原肽可诱导细胞聚集、呈现病理变化。这些结果初步表明circ_048的RNA可通过与蛋白互作、编码小肽发挥功能。BmCPV的S1-S10 dsRNAs基因组片段为单顺反子,每个基因组片段在病毒增殖复制中的作用仍不清楚。研究了过表达BmCPV的vp3、vp7、polh及其相应的无起始密码子的vp3-mut、vp7-mut和polh-mut基因,及S2和S5片段对BmCPV增殖复制的影响,发现过表达vp7、vp7-mut都能促进BmCPV的增殖,过表达S5(NSP5)能够抑制BmCPV的增殖,但没有发现过表达vp3/vp3-mut、polh/polh-mut对病毒增殖的影响。qPCR检测结果显示,过表达vp3/vp3-mut、vp7/vp7-mut对细胞免疫、凋亡相关基因的表达无明显影响。另外,细胞流式发现,过表达S5(NSP5)还能够促进BmN细胞由S期向G2期转换。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S884.51

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