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合成糖聚物对细胞膜的改性及对细胞功能调控的研究

刘琦  
【摘要】:细胞膜表面的糖作为细胞的最外层,是一类被细胞外环境最先识别的分子,因此细胞膜表面糖类参与了众多重要的生物过程,比如细胞分化、免疫反应、疾病进展及细胞的凋亡等。然而天然糖类结构的多变、异质和复杂性,限制了研究者们探索糖分子的结构和种类对特定细胞功能的影响,因此通过化学合成的手段制备结构规整可控的糖聚物并结合细胞膜表面改性方案将其修饰到细胞膜表面,有助于研究具有特定结构的糖聚物对细胞间的信号交流以及细胞功能的影响,为细胞膜表面工程的发展提供方法论指导及应用基础。基于以上思路,本论文围绕“合成糖聚物对细胞膜的改性及对细胞功能的调控研究”这一主题展开了系列研究工作。鉴于细胞膜表面糖类在调控胚胎干细胞(ESCs)分化行为和免疫反应这两个过程中的重要性,本论文利用合成糖聚物修饰到细胞膜表面实现对上述两种过程中细胞功能的调控。首先通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合与聚合后修饰(PPM)相结合,制备了新型的磷脂化糖胺聚糖类似物,系统研究了其对不同种类细胞膜表面的修饰,以及对小鼠ESCs(mESCs)神经分化行为的影响和对特定信号通路的调控作用,为细胞膜表面糖类和受体参与的ESCs其他分化行为的研究提供了新的途径和思路。鉴于磷脂化糖聚物在细胞膜表面的停留半衰期通常为几个小时,在后续的研究中我们进一步发展了一种基于膜结合HaloTag蛋白(HTP)平台在细胞膜表面稳定修饰外源糖聚物的方案,拟研究发生在较长时间尺度上的生物过程,例如免疫调控过程。我们结合了重组蛋白技术与RAFT聚合方法在细胞膜表面稳定修饰系列特定结构糖聚物,研究了不同种类的合成糖聚物修饰癌细胞后对巨噬细胞极化及树突状细胞成熟的影响,突出了癌细胞膜表面特定结构糖聚物在调控免疫细胞活性过程中的重要性,有望实现糖聚物改性的癌细胞在肿瘤免疫治疗中的应用。主要研究内容如下:(一)新型磷脂化糖胺聚糖类似物的合成及其对细胞膜表面的修饰。首先采用RAFT聚合方法,将4-乙烯基苯磺酸钠(SS)、N-甲基丙烯酰葡糖胺(MAG)和甲基丙烯酰氧基荧光素(FluMA)进行聚合,制备了一系列绿色荧光素标记的糖胺聚糖类似物(pSMF),进一步将聚合物末端还原成巯基后与合成的马来酰亚胺化的磷脂分子(MAL-DPPE)发生点击反应,从而将磷脂分子接枝到糖胺聚糖类似物主链上。通过核磁氢谱、红外以及聚合物溶液巯基密度的测定验证了磷脂化糖胺聚糖类似物(DPPE-pSMF)的成功合成。激光共聚焦显微镜荧光照片及单个细胞绿色荧光强度分布证明了 DPPE-pSMF成功结合到模型细胞HeLa的表面,而不带磷脂基团的pSMF则被HeLa细胞内吞;流式细胞仪结果证明了 DPPE-pSMF 结合到 HeLa 细胞膜表面的量有一定的聚合物浓度依赖性;并且结合到细胞膜表面的糖胺聚糖类似物具有促进L929细胞增殖的效果。(二)磷脂化糖胺聚糖类似物对mESCs细胞膜表面的修饰及其对mESCs神经分化的影响。倒置荧光显微镜图片证明了 DPPE-pSMF孵育mESCs细胞1小时后能成功修饰到mESCs表面上。用不同糖聚物诱导神经分化14天后的结果显示:DPPE-pSMF孵育细胞的β3-tubulin(神经元特异性表达marker)表达量分别达到pSMF和天然肝素孵育的细胞表达量的~1.9倍和~3.8倍,并且在相同的分化周期下,与pSMF和天然肝素孵育的细胞相比,DPPE-pSMF孵育的细胞分化的神经细胞更多。我们进一步探索了 DPPE-pSMF促进mESCs高效分化成神经细胞的机制,结果显示修饰到mESCs细胞膜表面的合成糖胺聚糖类似物可以增强成纤维生长因子2(FGF2)与细胞膜表面的结合,并增强了细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化,表明DPPE-pSMF修饰mESCs膜后增强了对FGF2-ERK1/2信号通路的激活。上述结果揭示了我们合成的特定结构糖胺聚糖类似物引入到mESCs能够促进其神经分化的高效性,且该细胞膜表面修饰糖聚物的方案也可以用于调控细胞膜表面受体介导的其他细胞功能。(三)基于HTP的蛋白融合技术与RAFT聚合相结合在细胞膜表面稳定修饰合成糖聚物。首先通过基因转染将合成的HTP质粒转染进HeLa细胞,筛选21天后得到细胞膜表面稳定表达HTP的HeLa细胞系(HTP-HeLa);进一步通过化学合成的手段制备了一种新型的氯代烷烃修饰的链转移剂(CPADB-C1),利用该合成的链转移剂进行了 MAG和生物素单体的RAFT聚合,得到氯代烷烃修饰的生物素标记的葡萄糖聚合物pMB。通过核磁及体积排除色谱(SEC)验证了pMB的成功制备。激光共聚焦荧光图片结果证明了 pMB于37oC下孵育HTP-HeLa 1 h可以成功修饰到细胞膜表面,并且其在细胞膜表面的停留时间长达7天,证明通过细胞膜表面结合的HTP在细胞膜表面引入外源糖聚物方案的稳定性。(四)不同结构合成糖聚物修饰的癌细胞对巨噬细胞极化及树突状细胞成熟的影响。循环肿瘤细胞在体内可以“自我归巢”到初生肿瘤或转移性肿瘤部位的特性表明肿瘤细胞可以作为携带治疗性试剂的载体。基于此,我们提出利用糖聚物改性的癌细胞来原位刺激肿瘤部位的免疫细胞,从而诱导抗癌活性的概念。首先验证了合成糖聚物修饰的癌细胞在体外刺激巨噬细胞极化和树突状细胞成熟的效果。以合成的CPADB-C1为链转移剂,分别进行了 MAG和N-甲基丙烯酰甘露糖胺(MAM)的RAFT聚合,得到氯代烷烃修饰的两种结构规整的糖聚物pMAG和pMAM,核磁和SEC验证了 pMAG和pMAM的成功制备。将合成的两种糖聚物修饰到HTP-HeLa表面分别得到pMAG-HeLa和pMAM-HeLa,结果表明pMAG-HeLa和pMAM-HeLa都具有促进U937向M1型极化的效果,糖聚物改性的癌细胞显著提高了 M1型巨噬细胞表面抗原CD86的表达,并且上调了促炎因子 IL-12p70、TNF-α和iNOS分泌水平;同时糖聚物改性的癌细胞还具有促进树突状细胞成熟的效果,且其在小鼠体内皮下注射时几乎没有致瘤性。这些结果展现了糖聚物改性的癌细胞在癌症免疫治疗中的应用前景。


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