miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究

【摘要】：目的:本实验主要研究食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中miR-106b-3p的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验确认miR-106b-3p的差异表达能够影响ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程。通过 TargetScan 以及双荧光素酶报告实验预测及验证miR-106b-3p在ESCC调控中的靶基因。最后,深入探讨miR-106b-3p调控ESCC恶性生物学功能的机制。方法:1、收集苏州大学附属第一医院和邯郸市第一医院的ESCC组织和癌旁样本3对,应用Agilent miRNAs表达谱芯片技术筛选出差异表达的miRNAs;2、RT-qPCR检测差异比较大的miR-106b-3p的表达水平;3、RT-qPCR 检测 miR-106b-3p 在 ESCC 细胞株(KYSE150、ECA109 和EC9706)和人正常食管上皮细胞(HET-1A)中的表达;MTT-8和克隆形成实验检测ESCC细胞株(KYSE150、ECA109和EC9706)和人正常食管上皮细胞(HET-1A)的增殖能力;4、将合成的 miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC 及 miR-106b-3p inhibitors 转染至 ESCC 细胞株(ECA109 和 KYSE150)中,RT-qPCR检测转染效率:MTT和克隆形成实验检测miR-106b-3p对ESCC细胞株(ECA109和KYSE150)增殖能力的影响,流式周期实验观察对周期分布的影响,Western blot实验观察对细胞周期、迁移、侵袭及EMT相关蛋白表达的影响,划痕实验观察对细胞非定向迁移能力的影响,Transwell迁移实验观察对细胞定向迁移能力的影响,Transwell侵袭移实验观察对细胞侵袭能力的影响,光镜观察细胞形态的变化,细胞黏附实验观察对细胞黏附能力的影响;5、构建ESCC细胞株(ECA109)裸鼠移植瘤模型,观察miR-106b-3p对ESCC细胞株移植瘤生长的作用;6、免疫荧光和Western blot实验检测ZNRF3在ESCC细胞株(KYSE150、ECA109和EC9706)和人正常食管上皮细胞(HET-1A)中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验检测ESCC细胞株(ECA109和KYSE150)转染miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC 及 miR-106b-3p inhibitors 后 ZNRF3 mRNA 和蛋白的表达;TargetScan 预测 miR-106b-3p 的靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR 和 Western blot 检测 miR-106b-3p 对 ESCC 细胞株(ECA109 和KYSE150)中Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、利用Agilent miRNAs表达谱芯片筛选出62个ESCC差异表达的miRNAs,其中ESCC表达上调的miRNAs 41个,下调的miRNAs 21个;2、RT-qPCR实验结果显示miR-106b-3p在ESCC临床组织样本的表达水平要显著高于其在癌旁中的表达;3、RT-qPCR 结果显示 miR-106b-3p 在 ESCC 细胞株(KYSE150、ECA109 和EC9706)中的表达要显著高于其在人正常食管上皮细胞(HET-1A)的表达;MTT和克隆形成实验结果显示ESCC细胞株(KYSE150、ECA109和EC9706)的增殖能力要显著高于人正常食管上皮细胞(HET-1A);4、转染 miR-106b-3p inhibitors 后,ESCC 细胞株(ECA109 和 KYSE150)中miR-106b-3p的表达水平显著降低,转染miR-106b-3p mimics后,ESCC细胞株(ECA109和KYSE150)中miR-106b-3p的表达水平显著升高;MTT实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株(ECA109和KYSE150)的增殖能力显著降低,而转染miR-106b-3p mimics后的增殖能力显著增强;克隆形成实验验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的克隆形成能力显著降低,而转染miR-106b-3p mimics后的克隆能力显著增强;流式周期实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株细胞阻滞在G1期,而转染miR-106b-3p mimics后的G1比例显著下调,且miR-106b-3p inhibitors能够显著抑制Cyclin D1蛋白的表达,促进p21和p27的表达,而miR-106b-3p mimics能够显著促进Cyclin Dl蛋白的表达,抑制p21和p27的表达;划痕实验和Transwell迁移表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的迁移能力显著降低,而转染miR-106b-3p mimics后的迁移显著增强;Transwell侵袭实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的侵袭能力显著降低,而转染miR-106b-3p mimics 后的侵袭显著增强;Western blot 实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显著抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显著促进MMP-2和MMP-9蛋白的表达;细胞形态和黏附实验表明,miR-106b-3p inhibitors 能够抑制 ESCC 细胞株对 collagen I、collagen IV 和 fibronectin 的黏附,而miR-106b-3p mimics 能够增强对 collagen I、collagen IV 和 fibronectin 的黏附;Western blot 实验表明,miR-106b-3p inhibitors 能够显著抑制 Snail、N-cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显著促进Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达;5、裸鼠移植瘤实验表明,抑制miR-106b-3p的表达能够显著抑制移植瘤的生长,而促进miR-106b-3p的表达则显著促进移植瘤的生长;6、免疫荧光和Western blot实验表明ZNRF3在ESCC细胞株(KYSE150、ECA109和EC9706)的表达要显著低于其在人正常食管上皮细胞(HET-1A)中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验结果表明,ESCC细胞株(ECA109和KYSE150)转染miR-106b-3p mimics后,ZNRF3 mRNA和蛋白的表达显著降低,转染miR-106b-3p inhibitors 后,ZNRF3 mRNA 和蛋白的表达显著升高;TargetScan 预测ZNRF3是miR-106b-3p的潜在靶基因,且双荧光素酶报告实验验证ZNRF3是miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR结果显示抑制miR-106b-3p的表达可以显著抑制Wnt和β-catenin mRNA的表达,促进GSK3β mRNA的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显著促进Wnt和β-catenin mRNA的表达,降低GSK3β mRNA的表达。Western blot实验示抑制miR-106b-3p的表达可以显著抑制Wnt和β-catenin蛋白的表达,上调p-GSK3β蛋白的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显著促进Wnt和β-catenin蛋白的表达,降低p-GSK3β蛋白的表达。结论:1、miR-106b-3p在食管鳞癌临床样本中显著高表达;2、miR-106b-3p可以显著促进食管鳞癌细胞株的增殖、周期、迁移、侵袭、黏附及EMT进程;能够显著促进食管鳞癌细胞移植瘤的生长;3、miR-106b-3p能够靶向作用于ZNRF3;4、miR-106b-3p可以显著促进Wnt/β-catenin信号通路的表达。