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卵母细胞中丙酮酸脱氢酶激酶4的作用及其机制研究

徐文丹  
【摘要】:研究背景和研究目的:哺乳类动物出生后,初级卵母细胞停滞在第一次减数分裂的前期,含有较大的核,为生发泡(GV)。研究显示,环磷酸腺苷(cAMP)可通过卵丘颗粒细胞与卵母细胞间的缝隙连接而在这两种细胞间穿梭流动,对卵母细胞维持减数分裂阻滞状态起到促进作用。性成熟后,卵泡生长启动,卵母细胞内cAMP水平下降,促卵母细胞成熟因子表达增加,初级卵母细胞开始生长并完成第一次减数分裂,生发泡破裂,排出第一极体,而在排卵后停滞于第二次减数分裂的中期即MⅡ期。卵母细胞成熟主要包括核成熟及质成熟,二者只有同步化,卵母细胞的发育才能最优化。卵母细胞发育与成熟的每个细胞事件,都依赖细胞内能量支持,线粒体是其能量工厂。卵丘细胞来源的丙酮酸是卵母细胞三羧酸循环(TAC)能量代谢的主要原料;而葡萄糖本身和/或糖代谢中间产物、脂肪酸和氨基酸,也可能是卵母细胞的能量代谢的底物。尤其是葡萄糖中间代谢产物-乙酰辅酶A,可转入线粒体进行氧化呼吸,合成大量ATP。脂肪酸β氧化(FAO)是卵母细胞成熟的另一个重要的能量来源。一分子脂肪酸氧化可氧化在线粒体内产生106个ATP而一分子葡萄糖大约为30个ATP,因而脂肪酸氧化是卵母细胞成熟和植入前胚胎发育能量产生的有效来源。β氧化抑制剂依托莫斯能抑制小鼠的卵母细胞的核成熟,另数项研究表明小鼠的核成熟也是需要脂肪酸的β氧化。但是,线粒体产能过程,也势必伴随产生大量的过氧化物(ROS),正常生理情况下卵母细胞内的抗氧化系统清除ROS,但如果氧化-还原系统失平衡,大量ROS导致氧化应激反应,则损伤细胞功能甚至导致细胞凋亡。除供能外,这些代谢中间物还可调节细胞内氧化还原状态、信号转导、渗透压,确保卵母细胞核和质成熟。一旦核成熟和质成熟受阻,或者核质成熟不同步,卵母细胞质量下降,胚胎发育潜能差。因此,明确卵母细胞成熟过程中细胞调控机制尤为重要。其次,卵母细胞在完成第一次减数分裂后阻滞在第二次减数分裂中期,在女性体内输卵管壶腹部或者体外培养液中等待授精,重新启动并完成第二次减数分裂。一般情况,卵母细胞最佳授精期因物种不同而不同,鼠、猴子和人最佳时间分别是排卵后8-12h、12-14、24小时。排卵后卵母细胞如果在期限内不授精或激活,或者经历体外培养过程没有在期限内试管授精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI),卵母细胞会逐渐衰老,即排卵后卵子老化,这将导致卵母细胞内ROS增加、线粒体结构及功能异常、进而纺锤体及染色体排列异常,也会发生遗传与表观遗传的改变,最终导致卵母细胞质量下降,胚胎发育不正常,甚至出现先天性缺陷及低出生率。研究发现,IVF及ICSI前如果人及小鼠卵母细胞在体外培养的时间延长,会使卵母细胞质量随时间而下降,胚胎质量也下降。因此,明确排卵后卵母细胞老化及其机制对生殖医学很重要,并有望寻找预防有排卵后卵母细胞老化的新靶点。丙酮酸脱氢酶激酶(PDKs)是由基因组编码的线粒体蛋白基因,其表达在不同组织中存在差异,表明它们可能有不同的功能。PDKs通过磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)E1a亚基使其灭活,从而丙酮酸无法脱羧成乙酰辅酶A,无法进入线粒体三羧酸循环即柠檬酸循环,产生ATP。目前,经鉴定哺乳类动物PDKs有4种同工酶:PDK1、PDK2、PDK3和PDK4,它们不仅表达的部位不同,其作用的E1a亚基磷酸化位点也是特异的,而且它们结构亲和力明显不同。PDK4是PDKs的其中同工酶之一,在心脏和骨骼肌肉中高度表达。我们研究发现,PDK4在人及小鼠卵巢中高表达。我们提出第一个科研假说:PDK4磷酸化PDH使其失活,进而阻断TAC使丙酮酸无法转变成乙酰辅酶A,影响丙酮酸这一产能通路:脂肪酸代谢增加,以满足卵母细胞的能量需求。因而,PDK4可被称为卵母细胞能量代谢的调节者。目前,对不同组织细胞内PDK4作用的研究取得了一些进展,其研究领域涵盖了抗骨质疏松、抗HIV、抗肿瘤、降血糖等多个方面;PDK4及其它亚型的抑制剂二氯乙酸(DCA)已被用于治疗一些线粒体疾病。研究发现,多种调控因子对PDK4表达有调节作用,如PPARy、PGC-1α、HNF-4、HIF-1、以及ERRα等。研究发现,在多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢PDK4的表达水平较正常女性的卵巢表达显著升高,提示PDK4可能与卵母细胞发育有关。细胞内的小分子物质腐胺,天然存在于细胞质内,由精氨酸和脯氨酸经线粒体内的鸟氨酸脱羧酶(ODC)转化而成。此外,外源性腐胺容易被吸收,并扩散整个机体。有兴趣的是,小鼠卵巢在排卵期间(即LH峰值期)呈现短暂的鸟氨酸脱羧酶和腐胺水平骤然升高现象;但年老小鼠卵巢的鸟脱羧酶活性下降、腐胺水平升高不明显。卵母细胞体外成熟期间,IVM培养液中添加腐胺可减少老年卵母细胞的非整倍体率。小鼠排卵前,在其饮用水中加入1%腐胺,可提高小鼠囊胚细胞数目,减少流产率,且出生活崽数是对照组两倍。进一步研究发现,外源添加腐胺可被快速吸收,也快速排出或被代谢,对小鼠胚胎和子代无毒性作用,雌雄后代可正常生长和并具有正常的生育能力。我们研究发现,在IVM培养液中添加腐胺可有效地提升高龄小鼠卵母细胞成熟率。同时,在IVM培养液中添加鸟氨酸脱羧酶特异抑制剂(DFMO),以抑制ODC1从而抑制内源性腐胺的生成,发现其卵母细胞成熟率降低;同时,在IVM培养液中添加腐胺时,高龄卵母细胞的ROS显著减少。我们提出第二个科研假说:小分子物质腐胺在卵母细胞内起抗氧化剂的作用,在高氧化应激环境中提供有效的细胞保护。基于以上两个科研假说,本文研究卵母细胞发育与成熟过程中的能量代谢调节,探讨PDK4在卵母细胞能量代谢调节中的作用;研究小分子物质腐胺通过PDK4调控能量代谢,以抑制细胞内ROS和氧化应激,进而延缓排卵后卵母细胞的老化。材料与方法:(一)卵母细胞减数分裂中PDK4的作用及其机制(1)收集8w的年轻C57/6J小鼠GV期、MⅡ期卵母细胞及卵丘细胞,9月的高龄小鼠MⅡ期卵母细胞及卵丘细胞,观察卵母细胞及卵丘细胞内PDK4的表达变化;(2)8w的年轻C57/6J小鼠GV期卵母细胞显微注射PDK4小干扰片段,观察卵母细胞GVBD率及第一极体排出率的改变;(3)8w的年轻C57/6J小鼠GV期卵母细胞显微注射PDK4小干扰片段,通过免疫荧光观察卵母细胞纺锤体分布、ROS及线粒体分布;(二)排卵后卵母细胞老化过程中PDK4的作用及其机制(1)8w年轻的C57/6J小鼠排卵后卵母细胞体外培养过程中,在培养液中添加腐胺,观察卵母细胞形态改变,通过TUNEL及免疫荧光检测卵母细胞凋亡变化;(2)8w年轻的C57/6J小鼠排卵后卵母细胞体外培养过程中,在培养液中添加腐胺,免疫荧光观察卵母细胞ROS改变,检测Sirt1-Foxo3a-SOD2通路相关因子的改变;(3)8w年轻的C57/6J小鼠排卵后卵母细胞体外培养过程中,在培养液中添加腐胺,观察卵母细胞线粒体分布、线粒体膜电势、线粒体自噬的改变,同时检测自噬通路mTOR的相关因子的表达;(4)8w年轻的C57/6J小鼠排卵后卵母细胞体外培养过程中,在培养液中添加腐胺,观察抗凋亡通路AKT/ERK1/2蛋白的变化;观察线粒体凋亡通路蛋白Bcl2、BAX、caspase9的表达水平的变化;(5)8w年轻的C57/6J小鼠排卵后卵母细胞体外培养过程中,在培养液中添加腐胺,通过免疫荧光、qPCR、western bolt观察卵母细胞PDK4的表达变化;(6)8w年轻的C57/6J小鼠排卵后卵母细胞体外培养过程中,在培养液中添加腐胺的同时显微注射PDK4小干扰片段,通过免疫荧光等技术观察干涉后卵母细胞ROS、线粒体分布、线粒体膜电势及卵母细胞凋亡的改变;(7)统计学方法:SPSS 17.0软件进行统计学处理,所有数据以均数±标准差(Means±SD)表示,两组数据独立样本t检验分析,三组数据卡方检验分析。P0.05代表统计学有显著性差异。结果:(一)卵母细胞减数分裂中PDK4的作用及其机制(1)年轻小鼠MⅡ卵母细胞PDK4的表达水平较GV期卵母细胞有显著上升(P0.05);高龄小鼠MⅡ卵母细胞内PDK4的表达较年轻小鼠MⅡ卵母细胞PDK4的表达有明显降低改变(P0.05);年轻小鼠MⅡ卵丘细胞PDK4的表达水平较GV期卵丘细胞有显著性的增高改变(P0.05);高龄小鼠MⅡ卵丘细胞内PDK4的表达较年轻小鼠MⅡ卵丘细胞PDK4的表达有明显降低改变(P0.05);(2)年轻小鼠GV期卵母细胞干涉PDK4表达后,卵母细胞GVBD从89.14%下降至54.55%(P0.05);卵母细胞第一级体排出比率从82%下降至63%(P0.01);(3)年轻小鼠GV期卵母细胞干涉PDK4表达后,干涉效率为53%,卵母细胞ROS积累增加(P0.05),卵母细胞纺锤体排列异常比率增加(P0.05),卵母细胞线粒体的分布异常比率也增加(P0.05)。(二)排卵后卵母细胞老化过程中PDK4的作用及其机制(1)排卵后卵母细胞体外培养24h,显微镜下观察到排卵后24小时后卵母细胞异常形态改变增加(P0.05),而添加腐胺组的排卵后24小时的卵母细胞,卵母细胞异常形态改变降低(P0.01);通过TUNEL检测卵母细胞在排卵后24h细胞凋亡阳性比率增加(P0.05),在添加腐胺后卵母细胞的凋亡阳性比率下降(P0.05),同时免疫荧光观察卵母细胞凋亡蛋白caspase3的活性形式表达在排卵后24h的卵母细胞中增加(P0.05),在添加腐胺后卵母细胞caspase3的活性形式表达下降(P0.05);(2)排卵后卵母细胞体外培养24h,免疫荧光检测到卵母细胞在排卵后24h,细胞ROS水平较新鲜卵母细胞增加(P0.05),在添加腐胺后卵母细胞ROS水平下降(P0.01),同时qPCR及western blot均检测发现卵母细胞内抗氧化蛋白SOD2的表达在排卵后24h降低(P0.05),在添加腐胺后卵母细胞较未添加腐胺组SOD2的表达增加(P0.05);western blot检测发现卵母细胞内抗氧化通路蛋白Sirt1的表达在排卵后24h降低(P0.05),在添加腐胺后卵母细胞Sirt1的表达增加(P0.05);排卵后24h,Sirt1下游Foxo3a蛋白表达下降(P0.05),添加腐胺后其表达上升(P0.05);(3)排卵后卵母细胞体外培养24h,免疫荧光检测到卵母细胞在排卵后24h细胞线粒体分布异常率较新鲜卵母细胞增加(P0.05),在添加腐胺后,卵母细胞线粒体分布异常减少(P0.05);在排卵后24h线粒体膜电势较新鲜卵母细胞下降(P0.01),添加腐胺后卵母细胞膜电势增加(P0.05);在排卵后24h线粒体自噬较新鲜卵母细胞下降(P0.05),在添加腐胺后卵母细胞自噬水平上升(P0.05);同时western blot检测卵母细胞p-mTOR的表达在排卵后24h上升(P0.05),而在添加腐胺后卵母细胞较未添加腐胺组p-mTOR的表达下降(P0.05);(4)排卵后老化的卵母细胞p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平较新鲜卵母细胞蛋白水平降低(P0.05,P0.05),抗凋亡蛋白BCL2表达下降(P0.05),促凋亡蛋白BAX表达增加(P0.01),而添加腐胺组卵母细胞p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平较老化的卵母细胞蛋白水平增高(P0.01,P0.05),抗凋亡蛋白BCL2表达增加(P0.05),促凋亡蛋白BAX表达减少(P0.01)。免疫荧光结果显示排卵后老化的线粒体凋亡行使蛋白活化形式cleaved-caspase9的表达也比新鲜卵母细胞的表达增加(P0.05),而添加腐胺组卵母细胞线粒体凋亡行使蛋白活化行使蛋白cleaved-caspase9的表达较老化的卵母细胞减少(P0.01);(5)排卵后卵母细胞体外培养24h,通过免疫荧光、qPCR、western bolt检测卵母细胞PDK4的较新鲜卵母细胞下降(均P0.05),而排卵后的卵母细胞添加腐胺组,卵母细胞PDK4的表达有所增加(分别为P0.05,P0.01,P0.05);(6)排卵后卵母细胞体外培养液中添加腐胺的同时显微注射PDK4小干扰,通过western bolt观察到PDK4的表达下降(P0.05),干涉效率约为60%。然后,通过免疫荧光观察干涉PDK4后的卵母细胞较仅添加腐胺组的卵母细胞,其ROS水平增加(P0.05)、线粒体分布异常比率增加(P0.05)、线粒体膜电势下降(P0.05)及卵母细胞凋亡水平也增加(P0.05)。结论:(一)卵母细胞减数分裂中PDK4的作用及其机制(1)卵母细胞成熟即完成第一次减数分裂中PDK4表达增加,可通过促进卵母细胞线粒体功能,促进卵母细胞成熟;(2)PDK4促进卵母细胞完成减数分裂,其具体机制可能与调控能量代谢有关,这对理解卵母细胞减数分裂的分子机制及寻找提高体外成熟的卵母细胞质量的靶点有重要意义。(二)排卵后卵母细胞老化过程中PDK4的作用及其机制(1)卵母细胞过熟即排卵后老化时,PDK4表达下降,PDK4可抑制卵母细胞的老化,而小分子腐胺可通过促进PDK4的表达,抑制卵母细胞的老化。(2)这对了解排卵后卵母细胞老化的具体分子机制及寻找抑制排卵后卵母细胞老化的靶点有重要意义。


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