胡萝卜（Daucus carota.L.）细胞外周糖蛋白结构及翻译后修饰的研究

【摘要】： 细胞外周糖蛋白(EDGP)是一种在SDS-PAGE中显示分子量为57000Da的糖蛋白，它由两种多肽构成，其氨基酸组成相似但等电点不同，pI分别为8.8和9.5。用层析法和层析等电点聚集法，从胡萝卜细胞悬浮培养液中提取和纯化了目的蛋白EDGP。应用MALDI-TOF-MS对纯化的蛋白质进行了鉴定。同时，将光谱测定数据与蛋白质数据库进行了符合率鉴定(MS-Fit)，结果表明纯化的蛋白质确为EDGP。利用电喷雾质谱法对未变性的纯化EDGP的分子量进行鉴定，EDGP中含有4种分子量，分别为：48119 Da，48282 Da，48479 Da，和48705 Da。通过MALDI-TOF-MS，证实检测的氨基酸序列与佐藤等(1992)推导的EDGP氨基酸全序列相一致。测定结果表明，EDGP前20个氨基酸残基为信号肽序列，它在EDGP的成熟过程中被切除；成熟EDGP的N-末端被焦谷酰胺磷酸化修饰；EDGP的氨基酸序列中有11个潜在的磷酸化位点，其中7个没有被磷酸化修饰；在EDGP胰蛋白酶的水解产物中，这些未被磷酸化的多肽是T1、T5、T11、T15、T19、T23和T25。 通过用正碘乙酰-(5-硫基-1-奈基)乙二氨(1，5-I-AEDANS)对半胱氨酸的特异性荧光标记，并结合MALDI-TOF-MS对EDGP是否含有自由半胱氨酸进行了鉴定，结果表明：在EDGP中不含有自由半胱氨酸，即在EDGP序列中的12个半胱氨酸，形成分子内二硫键。通过比较存在或缺少还原剂条件下的肽谱差异，并依据MALDI-TOF-MS的分析结果，证实EDGP的半胱氨酸70与半胱氨酸158之间形成了二硫键。