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《苏州大学》 2001年
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抗辐射菌DNA修复蛋白LexA的表达,纯化和鉴定

孔向蓉  
【摘要】: 抗辐射菌Deinoeoccus radiodurans(Dr)是一种对电离辐射,紫外线及其他一些DNA损伤剂具有显著抗性的微球菌。该菌能在辐照后几小时内准确无误地修复每条染色体上至少150多个DNA双链断裂(DSB)。已有的研究表明该独特抗性归功于其高效精确的DNA损伤修复能力。然而,对其修复路径及机制知之甚少。D.radiodurans中是否存在SOS修复路径,及在E.coli等菌中广泛存在的LexA修复蛋白在D.radiodurans 中的功能特性如何均是未解之迷。本研究利用已克隆构建的D.radiodurans lexA基因重组质粒pZA172,转化大肠杆菌JM109并在IPTG诱导下获得了高效表达,Dr LexA分子量约25.4KDa。实验表明IPTG浓度为0.1 mM,诱导时间为24 h时LexA蛋白表达效果最佳。大体积培养表达菌时,氨苄青霉素浓度为25 μg/ml及IPTG诱导浓度为0.1mM时,LexA表达量较高。 我们对表达产物进行了纯化并进一步研究了纯化LexA的功能特性。培养细胞经溶菌酶,反复冻融,超声等裂解破膜后,再通过高速离心,层析,超滤浓缩等技术使LexA逐步得到纯化。在层析分离阶段,Dr LexA表现出对生物肝素的高度亲和性,表明其为DNA结合蛋白。且与E.coli等菌LexA类似,Dr LexA亦与强阳离子交换柱相结合。大部分LexA蛋白经肝素柱及阳离子交换层析(SP Sepharose)后分离得到,洗脱峰分别在250 mM NaCl及400 mMNaCl左右。蛋白纯化程度达95%以上,产量为10L(约17.3 g)表达菌可获得约2 mg纯化蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的蛋白为一分子质量25.4KDa的单一蛋白带。纯化蛋白用于制备抗体及进一步研究。 利用凝胶阻抑电泳实验分析了纯化的LexA蛋白的DNA结合特性。PCR扩增与DNA修复相关的D.radiodurans pprA,orf144c,recA基因上游序列并用地高辛标记作探针,与纯化Dr LexA反应后应用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果表明,与E.coli LexA不同,Dr LexA与D.radiodurans 修复基因pprA,orf144c,recA启动子序列无明显结合位点,而只与lexA基因有结合区域,说明其不参与RecA等蛋白的负反馈调节。然而类似E.coliLexA,Dr LexA的水解特性表现为在碱性条件下D.radiodurans LexA自动降解,以及生理pH 抗辐射菌DNA修复蛋白LexA的表达,纯化和鉴定 中文摘要 条件下可被激活的ReCA蛋白促进降解。单链DNA及Ah的存在则为ReCA 蛋白激活所必需。对x-射线损伤引起的不同D.radiodurans 菌株LexA蛋白 D 表达量变化的研究表明,RecA+D.radiodurans 细胞受损后,细胞内 LexA蛋 白表达量明显下降,而recA基因缺陷的rec30照射后LexA蛋白减少不明显。 此结果与RecA蛋白促进的LexA降解反应相对应。研究同时发现在DNA损 伤敏感型D.radiodurans 细胞中,LexA蛋白的减少远远大于损伤抵抗型细胞, 原因尚不清楚。 我们在本研究中成功构建了D.radiodurans lexA基因缺损突变体XEI。 通过在 D.radiodurans lexA酶切位点 Ea 互插入一段长 0.9 Kb,含D catalase 启动子序列及CAT报道基因的外源DNA片段(KatCAT),进而使lexA基因 失活的重组方法,构建了突变基因重组质粒pXKE6。琼脂糖凝胶电泳证实其 DNA长度为 9石 Kb。利用Hind Ill酶切鉴定其插入KatCAT片段的方向。再 用含有正确插入方向的重组质粒进一步转化D.radiodurans KD8301细胞后, 经药物选择性筛选出同源重组突变体。突变体经PCR扩增及Southern杂交被 鉴定。Western杂交分析亦进一步证实了XE突变体中没有LexA蛋白的表达。 对 lexA基因的缺陷突变体 XEI 的研究表明,其辐射抗性与 lexA+ D. radiodurans KD8301相近,存活曲线上显示有一个宽大的肩区,证实 lexA基 因的缺陷对抗辐射菌的辐射抗性无明显影响,说明D.radioduans LexA蛋白 可能并不具有类似E。。h等LexA的负反馈调控相关DNA修复基因的机制。 同时,细胞受照后的蛋白印迹实验显示lexA基因的缺陷不干扰辐射诱导的D. radiodurans RecA蛋白的表达,说明RecA的调控并不依赖于LexA蛋白,该 结论与LexA蛋白与recA上游基因序列无结合位点的证据相吻合。然而,与 lexA+KD8301细胞受照后修复蛋白PprA的大量表达相反,受照后的XEI细 胞中没有检测到 PprA蛋白的表达,提示lexA基因的缺陷干扰了 D.radiodurans pprA的转录。综合本文的研究结果,表明D.radiodurans LexA与其同源E。* LexA在功能及特性上同时存在相近及不同之处,提示了抗辐射菌的DNA损 、伤修复是一个多种基因参与的复杂的过程,有其独特的调节机制。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R341

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