人可溶性TRAIL重组腺病毒治疗肝癌的实验研究
【摘要】：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)属于肿瘤坏死因子超家族成员，它通过与死亡受体结合来引起凋亡。与其他细胞因子不同，TRAIL特异性的与它的受体结合来介导凋亡：与TRAIL-R1／DR4和TRAIL-R2／DR5结合将引起凋亡，而与另两个诱骗受体TRAIL-R3／DcR1和TRAIL-R4／DcR2结合则不能介导凋亡。TRAIL能够特异性地诱导转化细胞、肿瘤细胞而对正常组织细胞没有杀伤作用，正是这一特征，使其具有潜在的靶向抗癌前景。
为了观察TRAIL重组腺病毒对肝癌的杀伤作用，首先从正常人外周血单个核细胞中RT-PCR克隆人可溶性TRAIL基因，核酸测序结果与Genebank上的完全一样。在此基础上利用Cre／loxP位点特异性重组系统构建腺病毒载体。将pUC19-TRAIL克隆到腺病毒穿梭载体pDC315上，与5型腺病毒右臂质粒pBGHloxPΔE1E3通过Lipofectamine2000共转染至293细胞而发生重组。同时重组腺病毒Ad-TRAIL在其中复制和扩增，经反复“感染—收集—冻融”，将感染后的293细胞裂解上清Cscl梯度超速离心纯化，测定Ad-TRAIL滴度为7×10~(10)pfu／ml。本实验构建的腺病毒为下一步实验奠定了基础。
体外分别以MOI为0.1的Ad-TRAIL感染人肝癌细胞株，第3、7、10天在荧光显微镜下根据GFP的表达计算感染率分别是5％、58％和95％。在感染后的肝癌细胞内RT-PCR扩增到了TRAIL的mRNA，应用ELISA检测培养上清中TRAIL蛋白的浓度为10ng／10~6／48小时，western blot检测到32.5KD的TRAIL蛋白，证明腺病毒能有效地感染靶细胞，并介导所携带sTRAIL的表达。MTT检测发现：携带Trail基因的增殖缺陷型腺病毒Ad-Trail对肿瘤细胞的杀伤力依细胞的不同而有所不同，Hep3B、PLC／PR／F5较敏感，7721敏感性差，而对HepG2则没有杀伤力。携带绿色荧光蛋白报告基因的病毒Ad-EGFP对细胞的杀伤，要在很高的MOI值时才出现，而Ad-Trail对细胞的杀伤则在相对较低的MOI值时就已经出现了，提示Ad-Trail的杀伤力强于Ad-EGFP。由此证实，Trail基因对肿瘤细胞有一定强度的抑制或杀伤作用。
人可溶性TRAIL重组腺病毒治疗肝探的实验研究中文提要
7721细胞对Trail基因敏感性差。我们在转染了Caspasc一3基因的7721细胞
(sMMC7721八eE)内，Trail基因对7721细胞的杀伤作用明显增强。
肿瘤内注射1 x logpfu的Ad一TRAIL对HeP3B肝癌有明显的治疗作用。建立裸鼠
的异位肝癌模型，分别肿瘤内五次注射2x10乍fu的Ad一TRAIL、Ad一EGFP对照和PBs
对照，观察平均肿瘤大小。TLI]闷EL及电镜检查均提示治疗组肿瘤发生了凋亡。三组
荷瘤在治疗25天时的瘤体积分ZlJ为62.17士6.84、一06.12士23.5、x24.s6士28.77mm3，
三组相比有统计学差异。肿瘤生长得到有效的抑制。本研究为原发性肝癌基因治疗作
了进一步的探索。
【关键词】：TRAIL 肝癌 基因治疗 腺病毒 【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R735.7
【DOI】：CNKI:CDMD:1.2004.132013
【目录】：
- 前言16-18
- 第一部分 人可溶性TRAIL基因的克隆18-32
- 材料与方法18-24
- 结果24-27
- 讨论27-30
- 参考文献30-32
- 第二部分 利用Cre／LoxP位点特异性重组系统构建人可溶性TRAIL重组腺病毒载体32-52
- 材料与方法32-40
- 结果40-45
- 讨论45-50
- 参考文献50-52
- 第三部分 重组腺病毒Ad-Trail对肝癌细胞体外杀伤的初步研究52-67
- 材料与方法52-58
- 结果58-63
- 讨论63-65
- 参考文献65-67
- 第四部分 Ad-Trail对Hep3B肝癌的体内杀伤试验67-81
- 材料与方法67-71
- 结果71-76
- 讨论76-79
- 参考文献79-81
- 小结81-82
- 综述: 肝癌基因治疗研究新进展82-93
- 缩略词表93-94
- 致谢94
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