rhIL-24对A375黑色素瘤细胞体内外抗肿瘤效应及其分子机理的研究

【摘要】： 目的:为研究以hIL-24基因构建的原核表达载体pET-21a(+)/ hIL-24在大肠杆菌中表达及其部分纯化、复性得到的蛋白产物——重组人白介素24(rhIL-24)对A375黑色素瘤细胞体内外的抗肿瘤效应及其分子机理。 方法:以原核表达载体pBV220-hIL-24为模板构建新的pET-21a(+)/hIL-24重组原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得高效表达,将表达产物纯化、复性后得到初步纯化的rhIL-24,经Western-blot方法鉴定后,用rhIL-24刺激PBMC,收集细胞培养液上清,用ELISA方法检测PBMC分泌的IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量。用rhIL-24作用于体外培养的人A375黑色素瘤细胞,用MTT法去评价rhIL-24对A375细胞生长的影响,绘制出细胞生长曲线;通过流式细胞术(FCM),荧光染色等检测rhIL-24对A375细胞生长周期和凋亡的影响。用rhIL-24作用于鸡胚尿囊膜(CAM),观察其对血管新生的影响。在裸鼠真皮下建立人A375细胞黑色素瘤动物模型后,用rhIL-24治疗,测量瘤体的体积及重量以检测rhIL-24等对瘤体生长的抑制作用。用免疫组化检测肿瘤组织中的BAX、BCL-2、CD34及VEGF的表达情况,以确认经rhIL-24治疗后肿瘤细胞生长是否受到抑制及肿瘤组织血管新生是否减少。 结果:经PCR及酶切产物电泳证实所克隆的基因长度与理论值接近,经序列测定证实所克隆的基因与GenBank报道的hIL-24序列完全一致,为474bp。构建的原核表达载体pET-21a(+)/ hIL-24,经双酶切和PCR鉴定,原核表达载体构建正确。pET-21a(+)/ hIL-24转染的BL21宿主菌诱导表达后裂解菌体、提取包涵体的内容物,再进行SDS-PAGE电泳,有一条18.5KD左右的蛋白条带出现,与理论值一致。Western-blot检测该产物能与IL-24抗体形成特异性条带。含pET-21a(+)/ hIL-24的宿主菌BL21经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,rhIL-24在大肠杆菌中获高效表达。初步纯化的rhIL-24能刺激PBMC增加IL-6、IFN-γ及TNF-α的分泌, 72