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《苏州大学》 2007年
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人脑胶质瘤细胞发生发展相关基因CDC2的RNAi实验研究

陈骅  
【摘要】: 目的:胶质瘤是脑肿瘤中最主要的肿瘤,也是人类肿瘤中死亡率最高的肿瘤之一。尽管在胶质瘤治疗方面有不小的进展,然而其预后仍然很糟糕。究其原因在于胶质瘤发生发展确切的病因分子尚未完全阐明。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是细胞中双链RNA(double-stranded RNA ,dsRNA)介导的特定基因含同源序列mRNA降解从而特异性抑制该基因表达的方法。本实验设计和构建CDC2基因RNAi的表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)逆转录病毒重组载体,旨在提供细胞周期依赖激酶CDC2作为胶质瘤发生发展相关新分子的实验依据,并阐明其理论意义。 方法:利用Invitrogen在线软件设计RNA干扰CDC2基因靶序列,合成回文DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体扩增、抽提后双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞产生逆转录病毒,并利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。构建CDC2基因RNAi pSUPER表达siRNA逆转录病毒载体,并转染低分化SHG44-9胶质瘤细胞株,被转染的SHG44-9细胞由定量RT-PCR、Western blot测定CDC2表达量,流式细胞仪测定细胞周期、凋亡,检测细胞增殖生长能力。并在体外转染皮下和颅内荷瘤小鼠,通过移殖瘤质量和小鼠生存期观察其治疗效果。 结果: pSUPER表达siRNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入的60bp序列与原序列一致,位置正确。测定pSUPER.retro-C3病毒滴度值为4.25×105 CFU/ml。人脑胶质瘤细胞系SHG44转染针对CDC2的shRNA逆转录表达载体后,CDC2mRNA、蛋白表达显著下调,同时出现了明显的细胞G2/M期阻滞,转染后48h细胞生长抑制达到90%,细胞凋亡从3.97%上升至36.52%。裸小鼠皮下移植瘤CDC2治疗组肿瘤重量为32.0±16.5㎎,对照组为102.6±75.2㎎(n=16,P=0.021);CDC2蛋白表达明显降低,而细胞凋亡明显增加。与对照组相比,治疗组小鼠生存期明显延长。 结论:表达针对CDC2基因的siRNA逆转录病毒重组载体构建成功,不但为研究胶质瘤分子病因和基因治疗提供了有用工具,而且也为研究高表达CDC2的其它肿瘤构建了新的平台。CDC2基因过表达是胶质瘤发生发展病因分子之一,敲低其表达肿瘤的恶性增殖得到控制,表明CDC2可作为胶质瘤基因治疗的靶分子。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R739.4

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