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《苏州大学》 2007年
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重组鼠IL-12腺病毒转染库普弗细胞对脾T淋巴细胞免疫功能调节的体外实验研究

张卫东  
【摘要】: 目的:(1)分离纯化并鉴定SD大鼠库普弗细胞(Kupffer Cell,KC),得到较高纯度及活力的KC。(2)重组腺病毒Adv-IL-12体外转染KC,检测IL-12及MHC-Ⅰ类分子(H2-Kb)、MHC-Ⅱ类分子(I-Ab)的表达情况。(3)观察Adv-IL-12转染的KC对脾T细胞免疫功能的影响,为靶向治疗肿瘤肝内微转移的实验研究提供依据。 方法: (1)采用Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶E (PronaseE)灌注消化,Nycodenz密度梯度离心法得到SD大鼠肝脏非实质细胞(nonparenchymal cells,NPC),再以选择性贴壁法纯化KC。以台盼蓝拒染实验判断细胞产率和存活率;以细胞自发荧光现象、吞噬实验及ED-2单克隆抗体染色法对KC进行鉴定。(2)24孔细胞培养板中培养KC,细胞密度为1×106/ml,共设置3组,分别为KC细胞对照组(下称细胞对照组)、KC+Adv-EGFP病毒对照组(下称病毒对照组)和KC+Adv-IL-12试验组(下称实验组),每组设三个复孔。分别于转染后24h、48h收取3组细胞上清,以ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-12的表达量;转染后48h收集各组细胞,以半定量RT-PCR法检测MHCⅠ类分子(H-2Kb)及MHCⅡ类分子(I-Ab)mRNA对应于内参照三磷酸甘油醛(GAPDH)的相对含量。(3)常规制备大鼠脾淋巴细胞(Splenic lymphocyte,SLC),调整密度为2×106/ml,加入ConA(终浓度为5μg/ml)刺激培养72小时后,与事先以重组IL-12腺病毒转染的KC混合培养,SLC与KC之比为10:1,分4组:SLC+Adv-IL-12-KC组(A组)、SLC+Adv-EGFP-KC组(B组)、SLC+KC组(C组)、单独SLC组(D组),每组设三个复孔。共同培养72h后,收集各孔培养上清及SLC,ELISA法测定培养上清中IFN-γ和IL-4蛋白的水平;以荧光标记的抗大鼠CD4、CD8单抗染色,流式细胞仪测定各组SLC中CD4T、CD8T细胞亚群变化。 结果: (1)实验中每只SD大鼠可得到3.5-5.0×107个KC,细胞的存活率可达到93%以上;ED-2单抗染色鉴定,KC纯度达95%以上。(2)50 MOI剂量的重组腺病毒感染KC, ELISA检测:转染后24h,实验组上清IL-12浓度即明显升高,达对照组的10倍左右,48h测定IL-12浓度继续升高,实验组IL-12浓度可达1000pg/ml以上水平,与对照组比较差别具有显著统计学意义;而细胞对照组和病毒对照组KC也有一定的基础分泌,前者IL-12分泌量略低于后者,但差别不具有统计学意义。半定量RT-PCR法检测表明实验组H-2Kb /GAPDH和I-Ab /GAPDH比值分别为0.835,0.739,分别上调了1.5倍(H-2Kb)和2.0倍(I-Ab),与病毒对照组和细胞对照组比较差异有统计学意义,而病毒对照组和细胞对照组比较差异无统计学意义。(3)ELISA检测可见: A组、B组、C组和D组培养上清中IFN-γ含量依次为2026.29±103.37、988.55±94.39、1005.36±120.18、505.12±55.28(pg/mL),而IL-4含量依次为206.94±22.43、320.57±34.73、349.84±49.61、828.26±62.83(pg/mL)。FCM检测显示:A组SLC中CD4T细胞比例、T细胞总数(CD4T细胞和CD8T细胞之和)及CD4T/ CD8T比值均显著增大,与其他3组相比有显著差异,但CD8T细胞比例在各组间无明显差异;B组与C组、D组之间在各项指标上的差异不具有统计学意义;C组的CD4T细胞比例及T细胞总数高于D组,但两组CD8T细胞比例及CD4T/CD8T比值之间无明显差别。 结论: (1)采用Ⅳ型胶原酶、PronaseE灌注消化,Nycodenz密度梯度离心及选择性贴壁法能够分离出较高纯度和活力的KC,能满足进一步的实验要求。(2)在体外腺病毒载体能有效的转染KC;IL-12基因修饰后,KC能高表达IL-12蛋白;其MHCⅠ和MHCⅡ分子基因转录增强,说明IL-12基因修饰能够上调KC的抗原提呈能力。(3)IL-12基因修饰的KC细胞与脾淋巴细胞混合培养,能显著增加混合淋巴细胞中CD4T细胞的比例,而对CD8T细胞无明显影响,结果导致CD4T/ CD8T比值增大;由IL-12诱导的CD4T细胞增殖主要分化为Th1细胞,培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ的含量显著增加反映了这一变化,与此同时Th2方向的分化受到抑制,并表现为Th2型细胞因子IL-4分泌量的显著减少。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R392

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