收藏本站
《苏州大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

CD86人—鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究

胡玲玲  
【摘要】: B7分子(包括B7-1和B7-2,又称CD80和CD86)是表达在APC表面的共刺激分子,其与表达于T细胞表面的相应受体CD28/CTLA-4结合产生共刺激信号,对T细胞的活化和耐受起关键性调节作用。CD86为一个由1120bp的基因所编码,其基因序列与B7-1有26%的同源性,整个蛋白由306个氨基酸组成,属于I型跨膜糖蛋白。本研究在已获得稳定分泌鼠抗人CD86单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上,采用基因重组技术及细胞与分子生物学方法等进行了以下研究:1.CD86人-鼠嵌合抗体表达载体的构建及在CHO细胞中的表达 首先采用RT-PCR从特异性分泌抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D1中提取总RNA,常规逆转录,应用简并引物进行PCR扩增,并根据重、轻链基因序列分析结果设计引物,应用SMART-PCR方法扩增含信号肽序列的V_H和V_L基因,进行测序鉴定。在本科室构建的表达质粒PIRES/ch5C11基础上,通过PCR获得人IgG1γ链、κ链恒定区基因。将含信号肽序列的V_H序列和人的IgG1重链恒定区序列进行拼接获得嵌合重链,将含信号肽序列的V_L序列和人的κ链恒定区序列进行拼接获得嵌合轻链,拼接产物测序鉴定,构建共表达嵌合重、轻链的重组质粒pIRES/ch1D1。采用脂质体法将重组质粒转染293T细胞。以CD86-L929基因转染细胞株作为检测细胞,经流式细胞术对293T细胞培养上清鉴定后转染CHO细胞,再行鉴定后大量收集无血清培养上清,经Protein G亲和层析纯化及Lowry法定量。结果显示,本研究成功构建了含人-鼠嵌合重链和嵌合轻链基因的CD86人-鼠嵌合抗体真核表达载体pIRES/ch1D1。选择中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达宿主,经试剂盒抽提的pIRES/ch1D1嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选后进行亚克隆,获得持续稳定分泌抗人CD86人-鼠嵌合抗体(ch1D1)的基因转染细胞株(ch1D1-CHO)。RT-PCR鉴定结果表明ch1D1表达基因成功整合在ch1D1-CHO细胞中;FCM结果表明,转染pIRES/ch1D1质粒的CHO培养上清中的嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞膜型CD86分子的阳性结合率为98.5%。从CHO细胞培养上清中获取嵌合抗体纯化品的量约为3.0mg/L。 2.CD86人—鼠嵌合抗体的生物学活性的初步研究 采用间接免疫荧光及流式细胞术方法,对多株肿瘤细胞株Daudi、Sub-T、U937、Jurkat、HO8910、H1299及WERI-RB1细胞膜性CD86分子进行分析。在此基础上,选取天然高表达CD86及CD80分子的Daudi细胞为靶细胞,观察和分析了抗CD86嵌合抗体单独及联合抗CD80嵌合抗体对细胞生长和增殖的影响作用。将嵌合抗体(终浓度为5μg/mL)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(p<0.05),且CD86与CD80嵌合抗体具有协同抑制作用。将两个健康人外周血单个核细胞(PBMC)加入96孔板中,分别加入CD86嵌合抗体及联合CD80嵌合抗体(终浓度为5μg/mL),于培养72小时采用MTT法检测增殖情况。结果显示在双向混合淋巴细胞反应中,CD86嵌合抗体能抑制混合淋巴细胞的增殖效应,且CD86与CD80嵌合抗体具有协同抑制作用。 综上所述,本实验成功构建了CD86人-鼠嵌合抗体(ch1D1)真核表达质粒,并在CHO细胞中实现了稳定表达,表达的嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Daudi细胞的生长增殖具有抑制作用,并且在混合淋巴细胞反应中,能抑制混合淋巴细胞的增殖效应。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R392

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 黄莉;孙杰;郭静雅;高增燕;邱玉华;;siRNA沉默抗原递呈细胞表面CD86的表达对T淋巴细胞激活的影响[J];中国免疫学杂志;2011年08期
2 宋芳;周玉;卢士英;任洪林;李岩松;柳增善;刘文迪;郝亚明;;β-酪蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J];中国实验诊断学;2011年08期
3 吕大伟;;抗体的临床应用及类风湿性关节炎的抗体治疗[J];中国医药指南;2011年22期
4 裴冀男;;单克隆抗体制备例谈[J];高中生学习(高二版);2011年05期
5 谢晓玲;;恶性血液肿瘤的单克隆抗体靶向治疗[J];中外医学研究;2011年18期
6 孙厚良;魏大鹏;张小洪;刘彦君;章崇杰;;抗hMOF单克隆抗体的制备与鉴定[J];四川大学学报(医学版);2011年05期
7 ;新药速递[J];药学与临床研究;2011年04期
8 罗莎;;单克隆抗体成功治疗由出血性大肠杆菌引起的溶血性尿毒综合症[J];基因组学与应用生物学;2011年03期
9 孔桂美;张小荣;黄瑶;高巍;廖月霞;卜平;;人VEGF受体Ⅱ胞外Ⅲ区单克隆抗体研制与生物学活性测定[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2011年02期
10 曹黎黎;刘丹丹;卫娜;高明春;王君伟;;牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定[J];中国兽医科学;2011年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐爽;徐焱;;单克隆抗体在输血领域的应用探讨[A];中国输血1999年年会暨纪念ABO血型发现100周年学术交流论文专辑[C];1999年
2 李安民;;单克隆抗体标载的~(131)I治疗恶性脑胶质瘤Ⅱ期临床试验的三种给药途径的研究[A];第一届中国肿瘤靶向治疗技术大会论文集[C];2003年
3 于翠;施曼铃;王桂珍;吴建祥;周雪平;;几种重要植物病毒单克隆抗体的制备和快速检测方法的建立[A];第三次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集[C];2003年
4 刘振勇;邓国华;李呈军;张立春;田国彬;何后军;于康震;陈化兰;;抗禽流感H9N2亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备与分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
5 李振宇;赵益明;董宁征;沈飞;阮长耿;;抗FⅧ-C2区单克隆抗体的制备及鉴定[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
6 张改连;黄烽;;抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体rituximab治疗类风湿关节炎的临床研究[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年
7 郝波;张国新;林艳;杨杨;王宏娣;;抗HCCR单克隆抗体的制备及其在肝癌检测中的初步应用[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
8 陶薇;杨连华;何卓晶;洪艳;陈勇;;抗戊型肝炎病毒重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定[A];浙江省医学会医学微生物与免疫学及医学病毒学学术年会论文汇编[C];2009年
9 马翠卿;郭奕阳;顾海燕;曾瑞红;杨丽娟;魏林;;一株抗A族链球菌表面蛋白Fba的单克隆抗体对应的表位与Fba结合调节蛋白FH的位点重叠[A];河北省免疫学会第六次免疫学大会资料汇编[C];2010年
10 杨天兵;沈倍奋;;抗人重组白细胞介素1(rHIL-1)单克隆抗体的研制[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 文来;2010年单克隆抗体市场有望扩三倍[N];中国医药报;2005年
2 庄愉;单克隆抗体异军突起[N];医药经济报;2003年
3 ;单克隆抗体异军突起[N];中国高新技术产业导报;2003年
4 记者 尹晖;单克隆抗体研发进入新阶段[N];无锡日报;2010年
5 尹晖;最大单克隆抗体研制项目在马山奠基[N];无锡日报;2010年
6 记者 马波;滇将建首家单克隆抗体基地[N];科技日报;2000年
7 ;单克隆抗体应用前景看好[N];中国医药报;2002年
8 探微;单克隆抗体技术在中药研究中的应用初探[N];中国医药报;2006年
9 毛文波;单克隆抗体:征服癌症的新方法[N];科技日报;2004年
10 劳云信;单克隆抗体 抗击肿瘤的生力军[N];中国医药报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 唐琳;肝再生增强因子与肝癌发生、发展关系的研究[D];重庆医科大学;2005年
2 侯桂华;巨噬细胞移动抑制因子在同种移植排斥中作用及其机理的研究[D];山东大学;2004年
3 高勇;新型单克隆抗体荧光探针染料的合成及免疫荧光组织化学应用[D];西北大学;2006年
4 江敏;大鼠单克隆抗体的制备、鉴定、基因克隆、抗原分析以及药物偶联物的抗肿瘤作用研究[D];中国协和医科大学;1996年
5 秦迎松;人促血液血管细胞生成素(Haemangiopoietin, HAPO)单克隆抗体的制备、鉴定及应用[D];中国协和医科大学;2004年
6 万忠海;抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用[D];吉林大学;2008年
7 吕大伟;抗RANKL单克隆抗体在大鼠类风湿性关节炎模型中的应用及RANKL转录调控的探索性研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
8 庄国洪;抗DR4、DR5单克隆抗体诱导胶质瘤细胞株凋亡的研究[D];吉林大学;2004年
9 付建芳;溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的研究[D];第四军医大学;2005年
10 王晓洁;对虾白斑症病毒快速检测试剂盒的研制及其应用[D];中国海洋大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 胡玲玲;CD86人—鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究[D];苏州大学;2008年
2 陶然;鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制及应用研究[D];苏州大学;2006年
3 黄子逸;LIGHT基因转染细胞株和单克隆抗体的研制及其对T细胞的共刺激效应[D];苏州大学;2010年
4 李铁民;抗P-选择素单克隆抗体对大鼠胰腺缺血再灌注损伤的作用实验研究[D];中国医科大学;2003年
5 李晓龙;肝癌相关抗原SMP30 mRNA在癌细胞中的表达及其单克隆抗体的制备[D];广西医科大学;2010年
6 郑杰;分泌抗猪流感病毒(河南株)单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备、鉴定和初步应用[D];河南农业大学;2004年
7 邵炜慧;盐酸克伦特罗单克隆抗体的研制及初步应用[D];扬州大学;2005年
8 杨宁;纳豆激酶的纯化及其单克隆抗体的制备鉴定[D];山西农业大学;2005年
9 唐琦;抗麻痹性贝毒素GTX2,3单克隆抗体的制备及特性分析[D];暨南大学;2005年
10 贾娟娟;抗胰岛素单克隆抗体的研制及酶联免疫分析方法的建立[D];中国原子能科学研究院;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026