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《苏州大学》 2008年
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胶质瘤干祖细胞在恶性胶质瘤放射抗拒中作用的初步研究

沈云天  
【摘要】: 目的:胶质瘤干细胞研究已从体外细胞系或实体瘤组织中克隆干细胞阶段进入到以它作为靶细胞的实验治疗研究阶段。就胶质瘤放射治疗研究而言,首先要证明它是否是所在细胞群中最耐放射的一类细胞和其耐放射的机制何在。本研究旨在证明无论是来自体外培养的细胞系还是实体瘤组织中的干细胞都具有特别耐放射的特点,并初步阐明这一特点与其损伤的DNA得到优先修复有关,为进一步研究其耐放射的分子机制作准备。 方法:用含有生长因子N2、bFGF、EGF的无血清DMEM/F12培养基培养SHG-44,U251,以获取肿瘤干细胞球(SHG-44s和U251s);另外,还取本实验室己经建立的人脑胶质瘤干细胞SU-2球,扩增到实验所需的细胞量,进行X射线体外照射。在照射前后用流式细胞检测Hoechest33342,CD133比例,另一部分细胞做Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色;集落形成实验是分别在不同剂量照射后检测不同细胞系的存活分数。应用L-Q模型确定放射敏感性参数SF_2和SF_8及绘制剂量存活曲线。用RT-PCR检测U251、U251s与SU-2照射前后MGMT的mRNA水平。 结果:(1)SHG44、U251和SU-2在含生长因子条件下生长成悬浮的CD133~+和/或Nestin~+的球状物,可无限扩增,若重新转到含血清条件下培养时又可以表达神经元标志物NSE和星形胶质细胞标志物GFAP、且贴壁生长成瘤性神经元和瘤性胶质细胞,表明从体外细胞系及实体瘤中均克隆到了胶质瘤干细胞;(2)在流式细胞仪检测CD133~+细胞比例,SHG-44,U251分别为0.3%和0.1%,而SHG-44s,U251s,SU-2细胞中的CD133~+细胞比例则分别为1.0%,1.4%和4.6%,表明肿瘤干细胞球比其贴壁生长的细胞系中的CD133~+的干细胞比例要高一个数量级。(3)不同胶质瘤细胞系的SF_2与SF_8随CD133~+细胞比例增高而升高,说明不同胶质瘤细胞系的放射敏感性与肿瘤干细胞有相关性。U251,SU-2放射前后用相差显微镜及透射电镜观察,U251放射后细胞受损明显,增殖缓慢,SU-2细胞系放射后细胞损伤不明显,增殖仍迅速,表明胶质瘤干祖细胞比普通的胶质瘤细胞系对放射线明显抗拒。(4)使用流式细胞仪测定U251和SHG-44细胞系放射前后Hochest33342+/-和CD133+/-细胞的比例显示:两株细胞中Hochest33342~-的SP(肿瘤干细胞表型之一)细胞的比例逐渐升高;CD133~+细胞的比例,SHG-44从0.3%升高到1.0%、SU-2从4.6%升高到13.7%,表明照射后的细胞群,肿瘤干细胞得到优先存活。(5)RT-PCR检测U251s与SU-2照射前后均有MGMT的mRNA的表达,而U251中未见表达,表明肿瘤干祖细胞照射后的优先存活与其受损的DNA得到了及时修复有关。 结论:(1)从体外培养的胶质瘤细胞系和实体瘤中克隆到的胶质瘤干细胞,可以用于耐放射的研究;(2)不同胶质瘤细胞系的放射敏感性与肿瘤干细胞有相关性。(3)经照射过的胶质瘤细胞系中胶质瘤干细胞的比例增加和直接照射胶质瘤干祖细胞所出现的细胞受损不明显,是胶质瘤干祖细胞耐放射的直接征象,可作为进一步研究胶质瘤干祖细胞耐放射的客观依据;(4)DNA损伤修复基因MGMT在胶质瘤干祖细胞中表达而在对应的细胞系中不表达,是受损的胶质瘤干祖细胞DNA得以修复的分子基础。尚须探讨诸如信号传导、细胞凋亡等其它分子所起的作用。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R739.4

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