骨髓单个核细胞构建细胞化生物组织工程血管支架的实验研究

【摘要】： 第一部分:鼠骨髓来源的内皮祖细胞的体外培养及生物学特性的研究 目的将鼠骨髓来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells , EPCs)诱导培养成内皮细胞(endothelial cells , ECs),鉴定并观察其在体外增殖、分化过程中相关细胞表型的变化。 方法采用密度梯度离心方法获得鼠骨髓单个核细胞,分别用EGM-2培养剂进行诱导分化(实验组)和普通培养基培养(对照组),于培养4、7、10、14、21 d,用免疫荧光双标技术(CD34、VWF和FLK1等)鉴定EPCs,用MTT法分析EPCs增殖情况。于诱导分化后的1、4、7、10、14、21 d,用western blotting法检测VWF蛋白的水平,用RT-PCR和Real-time PCR法检测VEGFR 2(FLK1)、VWF的mRNA表达变化,并与未诱导培养的细胞进行比较。 结果鼠骨髓单个核细胞在诱导培养的4 d细胞开始贴壁,7 d细胞大多变为梭形,排列成“铺路石”样,而对照组的细胞生长状态差,形态不如典型的“铺路石”状;MTT结果表明10 d时EPCs达增殖高峰(P0.05);免疫染色表明,诱导培养7 d的细胞约90%呈VWF/CD34双荧光阳性,对照组的阳性率极低,随培养时间的延长阳性率无增加; western blotting结果表明,诱导培养1 d的细胞无VWF表达,培养4 d后表达逐渐增强, 10~14 d达高峰,21 d后稍减弱;Real-time PCR结果表明,培养1 d的细胞FLK1和VWF的mRNA表达低(P0.01),4 d后表达逐渐增强,14 d达高峰,21 d后略减少,未诱导细胞无表达。 结论本试验成功地从鼠骨髓单个核细胞中分离、诱导培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,P0～P3(1～21 d) FLK1和VWF等内皮细胞标志蛋白表达逐渐增强,P3(21 d)后略有下降;而未加诱导的不能生长成内皮细胞。该细胞可作为构建血管组织工程较为理想的内皮的种子细胞。 第二部分:鼠骨髓来源的平滑肌祖细胞培养、鉴定及生物学特性的研究 目的将鼠骨髓来源的平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells, SPCs),诱导培养成平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs),鉴定并观察其在体外增殖、分化过程中相关细胞表型的变化。 方法采用密度梯度离心方法获得鼠骨髓单个核细胞,用M-199条件培养剂进行诱导其分化,于培养4、7、10、14、21 d,用免疫荧光双标技术(α-SMA、CD14)鉴定SPCs。于诱导分化后的1、4、7、10、14、21 d,用western blotting法检测α-SMA蛋白的水平,用RT-PCR和Real-time PCR法检测α-SMA的mRNA表达变化,并与未诱导培养的细胞进行比较。 结果鼠骨髓单个核细胞在诱导培养的4 d细胞开始贴壁,7 d细胞大多变为梭形,14 d(第3代)融合时呈现典型的“峰”“谷”样形态;免疫荧光染色表明,培养4 d的细胞α-SMA/CD14开始出现双荧光阳性;western blotting结果表明,培养1 d的细胞无α-SMA表达,培养4 d后表达逐渐增强, 10~14 d达高峰,21 d后仍持续高水平;Real-time PCR结果表明,培养1 d的细胞α-SMA的mRNA表达低(P0.01),4 d后表达逐渐增强,14 d达高峰(P0.01),21 d后仍持续高水平,未诱导细胞无表达。 结论本试验成功地从鼠骨髓单个核细胞中分离培养出SPCs,在其体外扩增分化为成熟平滑肌细胞的过程中,α-SMA、CD14平滑肌细胞标志蛋白及mRNA表达逐渐增强。该细胞可作为构建血管组织工程较为理想的平滑肌的种子细胞。 第三部分:细胞外基质支架对内皮祖细胞生长影响的研究 目的研究鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)在细胞外基质压缩和未压缩支架上的生长特性,为EPCs生长寻找更新、更适合的生物组织工程支架。 方法将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建毯状细胞外基质支架(extracellular matrix ECM),一组给于一定压力形成压缩支架为实验组,另一组未压缩的支架为对照组,在两种支架表面种植骨髓来源的经诱导培养的第二代内皮祖细胞(EPCs)。分别于培养1、3、7、10、14、21 d,用免疫荧光技术(VWF)鉴定EPCs,用电镜观察和分析的支架表面结构以及EPCs在支架表面的生长情况。于诱导分化后的3、7、10、14、21 d,用western blotting法检测VWF蛋白的水平,用Real-time PCR法检测VWF的mRNA表达变化。于培养10 d,用流体力学的方法测定四组不同支架的扭矩。 结果1 h、3 h、5 h三个检测点的细胞贴壁率分别是:压缩组25.3%、60.4%、90.5%,未压缩组10.5%、30.4%、66.3%。分析1﹑3﹑7﹑10﹑14﹑21 d两组支架细胞的数量,结果表明随着时间的增加两组支架上细胞数明显增加,在1﹑3﹑7 d压缩组的细胞数明显高于未压缩组(p0.001),且压缩组细胞较未压缩组细胞形态成熟,与内皮细胞相似,10 d后细胞数无明显差异,但压缩支架上形成一个较平整的细胞平面,而在未压缩支架表面细胞形态不规则、高低不平、细胞间排列松散。western blotting检测表明3﹑7﹑10 d VWF蛋白在压缩支架上表达比未压缩支架上强,14 d后两者表达无差异。real-timePCR结果显示:两组不同支架上的EPCs均表达VWF基因,两组的表达量7 d后均显著增高(p0.05),14 d达高峰(p0.01),21 d仍维持较高水平,而在3、7、10 d三时段中的压缩组VWF基因表达量明显高于未压缩组(p0.05),14 d后实验组仍高于对照组,但无差异。压缩支架上种植细胞的扭矩明显低于其他三种支架(p0.01)。 结论压缩细胞外基质支架较未压缩的更能促进EPCs粘附、增殖和分化,压缩的支架可作为EPCs生长的载体,可作为一种新颖的合成人造血管的生物组织工程支架。 第四部分:细胞外基质支架对平滑肌祖细胞生长影响的研究 目的研究鼠骨髓来源平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells,SPCs)在细胞外基质支架上的生长特性,为SPCs生长寻找更新的生物组织工程支架。 方法将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建毯状细胞外基质支架(extracellular matrix ECM)。第二代SPCs种植于支架表面为实验组,种植于圆盖片上为对照组。于培养1、3、7、10、14、21 d,用免疫荧光技术(α-SMA)鉴定SPCs,用扫描电镜和透射电镜观察和分析的支架表面结构以及SPCs在支架上生长情况。分别于诱导分化后的3、7、10、14、21 d用western blotting法检测α-SMA蛋白的水平,用Real-time PCR法检测α-SMA的mRNA表达变化。 结果1 h、3 h、5 h三个检测点的细胞贴壁率分别是:实验组(支架)26.40%、61.40%、91.50%,对照组(圆盖片上)11.10%、30.55%、66.90%。分析在1﹑3﹑7﹑10﹑14﹑21 d两组细胞的数量,结果表明随着时间的增加两组细胞数明显增加,在1﹑3﹑7 d实验组的细胞数明显高于对照组(p0.001);扫描电镜显示在支架表面形成一个完整的较平整的细胞平面,细胞间排列紧密,细胞有较多的突起,如典型“平滑肌”形状;而对照组细胞形态不规则、高低不平、细胞间排列松散。透射电镜发现对照组的细胞为单层,而实验组平滑肌祖细胞为多层,呈三维立体结构,更接近天然血管的结构。western blotting检测表明3﹑7﹑10 dα-SMA蛋白在实验组表达比对照组强,14 d后两者表达无差异。real-time PCR结果显示:两组的SPCs均表达α-SMA基因,两组的表达量7 d后均显著增高(p0.05),14 d达高峰(p0.01),21 d仍维持较高水平;而在3、7、10 d三时段中的实验组α-SMA基因表达量明显高于对照组(p0.05),14 d后两组表达相当,无差异。21 d后实验组仍维持高水平,对照组明显下降(p0.01)。 结论细胞外基质支架能显著促进SPCs粘附、增殖和分化,可作为SPCs生长的载体,可作为一种新颖的合成人造血管的生物组织工程支架。 第五部分:内皮祖细胞和平滑肌祖细胞共同构建细胞化生物组织工程血管支架的研究 目的研究鼠骨髓来源平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells, SPCs)和内皮祖细胞(endothelial progenitor cells , EPCs)在细胞外基质支架上的生长特性,为生物组织工程血管寻找更新的种子细胞和支架。 方法将鼠骨髓来源单个核细胞( bone mononuclear cells, BMCs)分别用不同的培养基进行诱导分化,培养作为种子细胞。将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建毯状细胞外基质(extracellular matrix, ECM)支架,先在支架表面种植诱导培养骨髓来源的第二代SPCs,4 d后再种植上第二代的EPCs(实验组);而在圆玻片上(对照组)。用扫描电镜和透射电镜观察和分析支架表面结构以及细胞在两种不同载体上生长情况。 结果诱导培养的第二代SPCs,种植在支架上,4 d时倒置显微镜示SPCs在支架表面细胞融合呈现典型的“峰”“谷”样形态,当EPCs被种植10 d时扫描电镜显示在支架表面形成一个完整的较平整的细胞平面。透射电镜发现在多层平滑肌祖细胞表面有单层内皮祖细胞,呈三维立体结构,具有天然血管的内膜和中膜,更接近天然血管的结构。而对照组的细胞生长状态差,且为单层细胞结构。 结论BMCs将是组织工程血管最理想的细胞来源,细胞外基质支架能显著促进SPCs和EPCs粘附、增殖和分化,可作为SPCs和EPCs生长的载体,可作为一种新颖的合成人造血管的生物组织工程支架。