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《苏州大学》 2010年
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t-PA通过ERK和P38途径调节血管内皮细胞VEGF表达的实验研究

段鹏飞  
【摘要】: 第一部分VEGF165和t-PA双基因共表达载体的构建 目的:构建由pIRES载体介导的携带有血管内皮生长因子基因(VEGF165)及组织型纤溶酶原激活物基因(t-PA)的双基因共表达载体,为联合上述两种基因共表达治疗下肢深静脉血栓形成提供载体基础。 方法:①设计引物后,ECV304细胞提取总RNA,经逆转录(reverse transcription)得到目的基因的cDNA,经PCR得到目的基因扩增片段;②将VEGF165基因全长序列克隆至pMD19-T simple载体,构建p-MD19-T-VEGF165KpnI/EcoRI,并通过PCR、酶切和测序方法加以鉴定;③采用KpnI和EcoRI分步酶切法,分别酶切pMD19-T-VEGFKpnII/EcoRI重组质粒及pIRES载体,回收目的片段,构建VEGF165单基因表达载体pVEGF165-IRES;④t-PA基因RT-PCR扩增产物经回收纯化,与pMD19-T simpl载体连接,用XbaI和NotI双酶切、测序加以鉴定;⑤用XbaI和NotI分别酶切pMD19-T-t-PA XbalI/NotI及pVEGF165重组载体,并分别回收t-PA基因目的片段和pVEGF165-IRES载体片段,构建pVEGF165-IRES-t-PA双基因真核共表达载体。 结果:①成功从人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞中克隆出VEGF165和t-PA基因;②成功构建pVEGF165-IRES-t-PA双基因真核共表达载体;③体外转染血管内皮细胞后,t-PA基因的蛋白表达量较VEGF165基因的蛋白表达量低(30.6%),未达到实验预期目的。 结论:由IRES介导的双基因表达载体的下游基因表达量较低,该重组质粒转录后的表达是不等量的,需进一步探讨提高下游基因的表达量并延长其表达时间的有效方法以增强其治疗效应。 第二部分t-PA通过ERK和P38途径调节血管内皮细胞VEGF的表达实验一人t-PA腺病毒表达载体的构建 目的:构建携带组织型纤溶酶原激活物(t-PA)的重组腺病毒(Adt-PA)。 方法: t-PA基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,构建成pAdtrack-CMV-t-PA。pAdtrack-CMV-t-PA线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细菌中,实现细胞内同源重组。线性化重组质粒转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒颗粒Adt-PA。扩增重组腺病毒载体,荧光显微镜下观察绿色荧光表达,并对其进行酶切鉴定及病毒PCR鉴定。 结果:经酶切鉴定及病毒PCR鉴定和绿色荧光观察,证实成功构建了携带t-PA的重组腺病毒Adt-PA。经过两轮扩增后,病毒滴度可以达到2.56×109pfu/ml,该病毒滴度已能满足后续实验的要求。 结论:本实验成功构建了Adt-PA,病毒经扩增、纯化后滴度达到后续实验要求。 实验二t-PA影响VEGF表达的研究 目的:检测转染了重组腺病毒(Adt-PA)的ECV304细胞中VEGFmRNA转录和蛋白表达水平,以评估t-PA对ECV304细胞VEGF表达的影响。 方法:取生长活跃的ECV304细胞,转染不同病毒滴度t-PA,转染比率(细胞:病毒)分别为l:10、l:50、l:100,观察细胞增殖情况,选取合适MOI值;将Adt-PA转染ECV304细胞后使用Westernblot方法检测细胞内t-PA蛋白的表达;然后将ECV304细胞分为2组,分别在培养液中加入Adt-PA作为治疗组及空病毒Ad作为对照组,混合培养后选取24h和48h两个时间点使用RT-PCR实验结合凝胶成像系统分析ECV304细胞中VEGFmRNA的转录水平,Westernblot实验检测ECV304细胞中VEGF蛋白的表达水平。 结果:当MOI为1:50时对ECV304细胞增殖具有一定的促进作用;而1:100时对细胞生长影响明显;Adt-PA转染ECV304细胞后在72h内随着时间的延长其蛋白表达量也逐渐升高;ECV304细胞被Adt-PA转染后,其细胞内VEGFmRNA的转录水平和VEGF蛋白的表达量在24h和48h两个时间点较对照组均有明显升高,差异有显著性(P0.05)。 结论:外源性t-PA可显著增加ECV304细胞中VEGFmRNA的转录和蛋白表达水平。 实验三t-PA影响VEGF表达的相关信号通路研究 目的:研究外源性t-PA增加ECV304细胞中VEGFmRNA转录和蛋白表达水平过程中可能涉及的信号传导通路。 方法:将培养的ECV304细胞分为空病毒转染组(Ad)和转基因组(Adt-PA),在两组细胞培养液中分别加入Adt-PA和Ad后共同培养,Westernblot检测2组0h、24h、48h和72h ERK/P38/JNK磷酸化水平;为证明ERK信号通路在介导t-PA上调ECV304细胞VEGF表达过程中的作用,我们应用该通路的特异性阻断剂PD98059(PD)干预信号传导,以观察VEGF的表达变化,实验分组如下:空病毒组(Ad)、PD组、Adt-PA组和Adt-PA+PD组,Westernblot检测VEGF蛋白表达水平及ERK的磷酸化水平;为证明P38信号通路在介导t-PA上调ECV304细胞VEGF表达过程中的作用,我们再应用该通路的特异性阻断剂SB203580(SB)干预信号传导,以观察VEGF的表达变化,实验分组同上,Westernblot检测VEGF蛋白表达水平及P38的磷酸化水平;分别以PD和SB作用于ECV304细胞并采用Westernblot方法检测ERK和P38磷酸化水平变化以辨明ERK和P38信号通路的上下游关系。 结果:Adt-PA转染ECV304细胞后可明显激活ERK和P38,且随着时间的延长,磷酸化ERK(pERK)和磷酸化P38(p-P38)水平呈逐渐升高的趋势,磷酸化JNK水平无明显变化。两组pERK和p-P38值在24h、48h和72h相比,差异均有显著性;分别加入PD和SB的ECV304细胞中VEGF蛋白的表达量明显下降,且同一组的pERK和p-P38水平下降明显(p0.01)。转染Adt-PA后可使ECV304细胞中ERK的磷酸化水平增加,此种效应可被ERK信号通路的特异性阻断剂PD所抑制,但不被P38信号通路特异性阻断剂SB所抑制;同时,Adt-PA可促进ECV304细胞中P38激酶的磷酸化水平增加,此种效应可被SB所阻滞,并可被PD所抑制。 结论:Adt-PA转染ECV304细胞后上调VEGF表达的过程中,ERK和P38是级联信号传导途径,ERK处于P38的上游,其级联信号传导在上述过程的作用机制中扮演了重要的角色。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R654.4

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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