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《苏州大学》 2010年
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RAN干扰小鼠间充质干细胞系C3H10 T1/2中B7-H4表达的体外实验研究

唐灵涛  
【摘要】: 目的筛选有效的siRNA序列,研究靶向负性协同刺激分子B7-H4的特异性小干扰RNA(siRNA)对小鼠间充质干细胞株C3H10 T1/2(C3H10)中B7-H4表达的抑制作用,探讨C3H10细胞中B7-H4的免疫抑制作用及对小鼠淋巴细胞活化诱导细胞死亡(AIDC)的影响。 方法应用细胞免疫荧光、RT-PCR及Western blot等方法检测C3H10细胞中B7-H4的表达情况;设计并合成三对针对小鼠B7-H4基因的特异性siRNA和绿色荧光素标记的FAM-siRNA阴性对照序列,脂质体转染法将siRNA转染入C3H10细胞;通过荧光显微镜及流式细胞仪(FCM)检测表达绿色荧光素的C3H10细胞评估siRNA的转染效率;利用RT-PCR和Western blot的方法测定不同序列的特异性siRNA干预C3H10细胞后B7-H4的mRNA及蛋白表达水平,筛选出具有最大抑制作用的siRNA为最佳序列;利用RT-PCR确定最佳转染浓度;B7-H4靶向siRNA干预C3H10后,与小鼠的脾脏淋巴细胞共培养,用FCM行淋巴细胞计数及检测淋巴细胞周期和凋亡。 结果荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察发现C3H10高表达B7-H4;倒置荧光显微镜及FACS检测显示siRNA转染C3H10细胞的转染效率高达86.43%; 3对特异性siRNA对B7-H4 mRNA及蛋白均有不同程度下调,其中以siRNA-1下调B7-H4的作用最强,选为最佳特异性siRNA;siRNA-1不同浓度梯度下以50nM浓度为最佳浓度,使B7-H4 mRNA的表达下调85%,选为最佳浓度; C3H10可明显抑制经PHA刺激的淋巴细胞的活化和增殖,处于S期的淋巴细胞百分比接近0,此效应经siRNA-1干预C3H10细胞后消失;C3H10细胞可保护与其共培养的小鼠脾脏淋巴免受AICD,此效应经siRNA-1干预C3H10细胞后消失。 结论 1、小鼠间充质干细胞系株C3H10 T1/2高表达B7-H4。 2、将siRNA-FAM用INTERFERin? siRNA Transfection Reagent转染C3H10细胞,发现其转染效率很高。 3、针对小鼠B7-H4设计合成的3对siRNA对目的基因均有不同程度的抑制作用,其中siRNA-1的抑制效果最明显。 4、siRNA-1能够有效下调B7-H4的mRNA及蛋白表达水平,并呈浓度依赖关系。 5、C3H10细胞能够抑制经PHA刺激的小鼠淋巴细胞增殖和活化,使处于S期细胞明显减少,这种抑制作用与C3H10细胞中负性协同共刺激分子B7-H4相关。 6、C3H10细胞能够保护经PHA刺激的小鼠淋巴细胞免受AICD,此种保护机制与C3H10细胞中B7-H4分子相关。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329

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