收藏本站
《苏州大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究

方强  
【摘要】: 研究背景:疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒传染病,也是一个严重影响我国人民健康的重要问题。间日疟虽然病死率低于恶性疟,但流行范围更为广泛,我国的疟疾流行亦以间日疟为主。而且,间日疟的危害一直被低估,相应的研究也落后于恶性疟,有必要加强间日疟防治的研究。疟疾诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节,现有的病原学和分子生物学的诊断方法已不适应疟疾现场防治的需要。以检测疟原虫特异性抗原为诊断靶标的快速免疫诊断方法已在疟疾现场防治中得以应用并取得良好效果。但现有的疟疾快速免疫诊断方法尚不能特异性诊断间日疟,间日疟的现场防治中亟需间日疟特异性快速免疫诊断方法。建立cDNA文库,筛选调取功能性基因是一种成熟的发现功能基因(包括诊断靶标、疫苗候选分子等)的策略,目前尚无高质量的我国间日疟原虫红内期全长cDNA文库,因此,建立高质量的我国间日疟原虫红内期全长cDNA文库对筛选调取包括间日疟特异性诊断靶标在内的功能基因,促进我国疟疾防治工作具有重要意义。 谷氨酸脱氢酶(GDH)为疟原虫糖酵解中的关键酶,是一个潜在的诊断靶标,已建立的恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(PfGDH)快速免疫诊断方法已显示了较满意的效果。但间日疟原虫谷氨酸脱氢酶(PvGDH)尚未见报道。因此,克隆表达PvGDH,并制备抗PvGDH特异性单抗,可为进一步研制以PvGDH为诊断靶标的间日疟原虫特异性快速免疫诊断试剂奠定基础,从而为间日疟防治提供有力工具。 第一部分红内期间日疟原虫全长cDNA文库的构建与鉴定 目的:构建中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库。 方法:自未经治疗的确诊间日疟患者静脉采血,滤过去除白细胞后浓集含虫红细胞,提取总RNA,RT-PCR法逆转录合成cDNA第一链,LD-PCR合成cDNA第二链及双链cDNA,经蛋白酶K消化、Sfi I酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经Sfi I酶切的质粒载体连接,转化入DH5α感受态细胞。测定文库的库容和重组率。随机挑选48个菌落,以M13+-引物进行PCR,鉴定插入cDNA片段大小。 结果:构建的中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库原始库容为1.14×106,重组率为97.2%。重组子插入cDNA片段大小为900~2500bp之间。 结论:成功构建了中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库。 第二部分间日疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达 目的:克隆表达间日疟原虫谷氨酸脱氢酶。 方法:根据推测的PvGDH编码基因设计特异性引物,采用PCR自构建的中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库扩增PvGDH编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定后,亚克隆至pCOLDⅡ载体进行表达。通过ELISA和Western-blot检测正常人血清、间日疟患者血清、恶性疟患者血清与rPvGDH的免疫反应性;以表达的rPvGDH免疫小鼠制备抗血清,通过ELISA检测抗血清与rPvGDH的免疫反应性;并以Western-blot检测抗血清与间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原、正常红红细胞抗原的免疫反应性。 结果:PCR产物电泳结果显示所克隆的基因约为1450bp,基因测序结果显示克隆的基因为1442bp,与GenBank间日疟原虫Sal-I株基因组测序预测PvGDH编码基因有3个碱基差异,但编码氨基酸无差异,无内含子。经原核表达获得可溶性的PvGDH重组蛋白(rPvGDH),可为间日疟患者血清和恶性疟患者血清所识别,而不能被正常人血清识别。制备的PvGDH抗血清可以识别rPvGDH、间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原,而不能识别正常红细胞抗原。 结论:成功克隆了PvGDH,并表达了具有免疫学活性的rPvGDH。 第三部分间日疟原虫谷氨酸脱氢酶线性B细胞表位的预测与鉴定 目的:预测并鉴定PvGDH线性B细胞表位。 方法:利用生物信息软件分析PvGDH、PfGDH序列,预测PvGDH、PfGDH线性B细胞表位,并比较分析,预测特异性PvGDH线性B细胞表位;合成预测PvGDH线性B细胞表位肽,免疫小鼠,制备抗血清;通过ELISA和Western-blot检测抗血清与rPvGDH的免疫反应性;通过Western-blot检测抗血清与与间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原、正常红红细胞抗原的免疫反应性。 结果:预测出1个特异性PvGDH线性B细胞表位;该预测表位肽抗血清可以识别rPvGDH和间日疟原虫抗原,而不能识别恶性疟原虫抗原和正常红细胞抗原。 结论:预测并鉴定成功1个特异性PvGDH线性B细胞表位。 第四部分抗PvGDH单克隆抗体研究 目的:分别通过rPvGDH和PvGDH预测表位肽制备抗PvGDH单抗。 方法:分别利用rPvGDH和PvGDH预测表位肽作为免疫原免疫小鼠,制备抗PvGDH单克隆抗体,并检测制备的单抗的滴度和抗体亚类;通过ELISA和Western-blot检测制备的单抗与rPvGDH的免疫反应性。 结果:通过rPvGDH制备了4株单抗,通过PvGDH预测表位肽制备6株单抗,抗体滴度均大于1:2430;通过PvGDH预测表位肽制备的单抗中有2株抗体亚类为IgG1,其余均为IgG2b。10株单抗均可有效识别rPvGDH。 结论:成功地通过rPvGDH和PvGDH预测表位肽2种方法制备得到10株抗PvGDH单抗。
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R346

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李军;刘美杰;李勇;窦忠英;;重组蛋白包涵体的研究进展[J];安徽农业科学;2008年31期
2 王月丹,谢雍,陈慰峰;SARS病毒表面蛋白抗原决定簇的免疫信息学分析[J];北京大学学报(医学版);2003年S1期
3 李林海,李明,吴英松,王萍,田泽维;恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定[J];第一军医大学学报;2002年10期
4 李妍,宁云山,李莉,彭丹丹,董文其,李明;抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立[J];第一军医大学学报;2005年04期
5 方强;骆江坤;崔琢;齐文娟;胡元生;沈继龙;;猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的克隆与高效可溶性原核表达[J];南方医科大学学报;2010年02期
6 徐军强;袁方玉;詹发先;黄光全;江永忠;陈丽;陈辉;;套式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫方法的建立及其应用研究[J];公共卫生与预防医学;2009年02期
7 周水森;恶性疟快速诊断新技术—Dipstick方法[J];国外医学(寄生虫病分册);1996年04期
8 周升;张再兴;李丽;杨明东;;OptiMAL疟疾快速诊断试纸条的现场应用评价[J];中国热带医学;2006年09期
9 李林海,李明,吴英松,王萍;恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析[J];热带医学杂志;2001年01期
10 李传明,石佑恩;日本血吸虫成虫RNA的快速分离纯化[J];实用寄生虫病杂志;1997年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 梁秀丽;方丽云;吕晓丽;龚国琴;付云飞;魏战勇;;猪细小病毒Vaccine株VP2基因克隆与抗原性分析[J];安徽农业科学;2008年01期
2 胡守锋;陶志勇;夏惠;高琪;胡开明;;红内期间日疟原虫浓集纯化及免疫反应性研究[J];蚌埠医学院学报;2009年08期
3 胡明洁;吴守伟;刘辉;张静;方强;沈继龙;;干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较[J];蚌埠医学院学报;2011年08期
4 侯云霞,董文其,徐伟文,王萍,陈白虹,李明;抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选[J];第一军医大学学报;2001年04期
5 李妍,宁云山,郝文波,李莉,李明;恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究[J];第一军医大学学报;2003年12期
6 李妍;宁云山;洪燕华;刘宜楚;罗军;龙敏;董文其;李明;;抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备与鉴定[J];南方医科大学学报;2006年04期
7 胡凤玉;胡旭初;马长玲;徐劲;余新炳;;华支睾吸虫分泌/排泄抗原致大鼠肝纤维化[J];南方医科大学学报;2009年03期
8 冯健男,万涛,吴加金,沈倍奋;基于三维结构的抗原决定簇预测[J];分子科学学报;1999年02期
9 石照应;主性;冯会利;曲月秀;陈蓉;田兴贵;;贵州黑山羊肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及其蛋白抗原表位预测[J];贵州农业科学;2012年05期
10 于丹;江钢锋;;疟疾诊断方法研究进展[J];华南预防医学;2006年06期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 崔保安;魏战勇;;猪细小病毒vaccine株VP2基因克隆与抗原性分析[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
2 王德炳;郑姝颖;;SARS与免疫[A];第三届全国血液免疫学学术大会论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 迪佑福;[D];华中科技大学;2011年
2 王艳华;弓形虫代谢分泌抗原和表面蛋白1抗原表位研究[D];中国农业科学院;2011年
3 肖丹;海南省疟疾疫情时空分布特征及预测模型的构建与评估研究[D];第四军医大学;2011年
4 刘文兴;布鲁氏菌标记疫苗(M5-90-26)的鉴别诊断及其bp26蛋白的免疫原性分析[D];南京农业大学;2011年
5 陶志勇;间日疟原虫特异性抗原的筛选[D];苏州大学;2011年
6 佟平;鸡蛋卵转铁蛋白线性表位定位及热加工对其结构与过敏原性的影响[D];南昌大学;2011年
7 孙平平;基于噬菌体组合肽库筛选的B细胞表位预测研究[D];东北师范大学;2011年
8 吴英松;恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克隆、表达、单抗制备及疟疾诊断研究[D];第一军医大学;2001年
9 魏战勇;猪细小病毒体外增殖的抑制因素、VP2基因变异及核酸疫苗的研究[D];南京农业大学;2004年
10 格日勒图;鸡柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)MZ5-7基因免疫调节型DNA疫苗的构建及其免疫保护性试验[D];南京农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王树云;斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究[D];华中农业大学;2010年
2 刘国兴;华支睾吸虫成虫与胆管癌细胞相互作用蛋白的筛选[D];吉林大学;2011年
3 丁帅;我国间日疟原虫乙胺嘧啶抗性基因dhfr突变的分子流行病学研究[D];第二军医大学;2011年
4 赵辉;中缅边境恶性疟原虫的态型研究[D];昆明医学院;2011年
5 刘晓飞;中介蝮(Gloudius intermedius)神经毒素磷脂酶A_2原核表达包涵体的复性及低温可溶表达研究[D];陕西师范大学;2011年
6 胡明洁;江淮地区间日疟原虫乳酸脱氢酶基因多态性研究[D];安徽医科大学;2011年
7 齐红丽;非标准洗涤对长效蚊帐使用效果的影响研究[D];大理学院;2010年
8 彭绍兰;通道试验对长效蚊帐药效评价的研究[D];大理学院;2011年
9 陈启伟;口蹄疫A型病毒AF/72株主要B细胞表位的筛选鉴定[D];甘肃农业大学;2010年
10 张斌;LY6K重组蛋白的表达纯化及其在食管鳞癌检测中的研究[D];河北大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴丹,郭瀛军,林懿,孙树汉;猪囊尾蚴抗原DNA疫苗诱导的免疫保护效应[J];第二军医大学学报;2000年06期
2 颜宏利,孙树汉,陈蕊雯;利用生物信息学鉴定新发现的膜联蛋白亚家族anx32[J];第二军医大学学报;2002年04期
3 吴丹,王庆敏,陈蕊雯,朱维佳,陈祖欢,孙树汉;猪囊尾蚴抗原cC1 DNA疫苗和蛋白质疫苗联合诱导小鼠免疫应答[J];第二军医大学学报;2004年01期
4 翁屹,王丽琴,李霖;抗鼠疟iRNA诱导小鼠体内抗体的生成[J];第四军医大学学报;1991年05期
5 李妍,宁云山,郝文波,李莉,李明;恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究[J];第一军医大学学报;2003年12期
6 吉清,何凤田;包涵体复性的研究进展[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2004年06期
7 杨晓仪,林键,吴文言;重组蛋白包涵体的复性研究[J];生命科学研究;2004年02期
8 罗惠霞;李敏;王玉炯;;包涵体蛋白复性的几种方法[J];生物技术通报;2007年05期
9 朱希强,袁勤生;重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化[J];中国生物制品学杂志;2005年03期
10 田兴旺;张小华;;分子伴侣与蛋白质折叠的研究进展[J];陕西师范大学继续教育学报;2006年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 高兴政,叶鑫生,王述姮;间日疟原虫红细胞内期电镜观察[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1992年02期
2 刘多,罗树宏,舒衡平,傅冉定;影响间日疟原虫在蚊体内孢子增殖因素的研究[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1995年01期
3 何建文,蔡贤铮,张永生,王香凤,华德,王赛梅;应用聚合酶链反应在海南检测间日疟原虫的效果[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1999年06期
4 王元昌;RC-12和WR14,997对按蚊和恒河猴体内间日疟原虫的作用[J];国际医学寄生虫病杂志;1975年04期
5 吴开琛;四种按蚊对来自越南的间日疟的传播[J];国际医学寄生虫病杂志;1981年03期
6 庄国正;;二例形态变异的间日疟原虫[J];云南医药;1984年04期
7 祁兆平,赖福春;疟疾病原学检查方法的研究及使用现状[J];国际检验医学杂志;1992年05期
8 罗树宏,刘多,叶炳辉,舒衡平,付冉定;抗间日疟原虫红内期单克隆抗体的研制和鉴定[J];湖南医科大学学报;1995年03期
9 赵天顺,曹翠珍;人体间日疟原虫的异常形态1例报告[J];西南国防医药;2001年04期
10 张山鹰,陆惠民;间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因多态性研究进展[J];国外医学.寄生虫病分册;2004年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 程汉良;姬南京;彭永兴;申欣;吴陈晨;许建和;董志国;;草鱼乙酰辅酶A羧化酶基因全长cDNA克隆[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
2 李西雷;汪桂玲;李家乐;;三角帆蚌GPX基因cDNA全序列克隆及其结构特征[A];中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学会分会第十四次学会研讨会论文摘要汇编[C];2009年
3 李西雷;汪桂玲;李家乐;袁一鸣;;三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
4 ;Constructing cDNA Microarray to Isolate Novel Differentially Expressed Genes Related to Human Glioma and Characterizations of Novel Full-length Gene PPIL-3[A];中国抗癌协会神经肿瘤专业委员会第八届学术会议论文集[C];2011年
5 刘丹丹;李建梅;韩宏晓;王尚尚;曹李琴;许金俊;陶建平;;巨型艾美耳球虫免疫原性相异株间差异表达基因消减cDNA文库的构建与分析[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
6 兰欢;卜友泉;崔涛;汪长东;易发平;刘革力;宋方洲;;肿瘤相关新基因PRR11的全长cDNA克隆及其功能初步解析[A];重庆市生物化学与分子生物学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
7 裴宗飞;张文娟;牛钟相;;鸭补体C3d基因cDNA的克隆及鉴定[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年
8 郝丽;李和平;严历;;东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建[A];2010中国鹿业进展[C];2010年
9 熊梅;穆亚芳;刘家森;原东伟;郭东春;姜骞;林欢;曲连东;;兔肝cDNA文库的构建[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
10 李鹏;严洁;周开亚;;中华绒螯蟹翻译起始因子4G基因全长cDNA克隆和序列分析[A];第七届全国野生动物生态与资源保护学术研讨会论文摘要集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者陈超;日公开烟草cDNA盐基测序成果[N];科技日报;2003年
2 陆志城;你方唱罢我登场[N];医药经济报;2002年
3 赵一平;抗疟药联合用药方案研究备受关注[N];中国医药报;2007年
4 余志平 译;破译癌症的“黑匣子”[N];医药经济报;2002年
5 华夏证券研究所 崇松;生物芯片为何走不出实验室[N];中国经营报;2000年
6 美国Promega公司北京办事处 戴钢;服务新药开发:PROMEGA公司独树一帜[N];中国高新技术产业导报;2002年
7 谢建平 执笔;以促进人类科技创新为准绳[N];医药经济报;2001年
8 魏衍亮;要重视授予专利的形式条件[N];中国医药报;2004年
9 张喜;日本完成1.7万个水稻基因碱基对测序[N];农民日报;2001年
10 何增寿;食管癌相关基因研究获进展[N];中国医药报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 方强;间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究[D];苏州大学;2010年
2 覃川杰;瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)脂肪代谢相关基因cDNA的克隆及表达分析[D];华东师范大学;2010年
3 慎小晶;蝶蛹金小蜂cDNA文库抗菌肽基因筛选及表达研究[D];浙江大学;2010年
4 姜争;基于cDNA微阵列技术Ⅱ、Ⅲ期肠癌转移相关基因的筛选、鉴定及应用研究[D];复旦大学;2010年
5 徐庆刚;大熊猫Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆表达及胃和脾脏cDNA文库的构建[D];浙江大学;2009年
6 李锋;转录组学、蛋白质组学研究海州香薷Cu吸收与耐性分子机理及其cDNA文库的构建[D];浙江大学;2009年
7 邓清超;具有高传播能力的栗疫菌低毒力病毒CHV1-CN280的基因组序列测定与可侵染性全长cDNA克隆构建[D];南京农业大学;2009年
8 陶志勇;间日疟原虫特异性抗原的筛选[D];苏州大学;2011年
9 葛荣朝;小麦耐盐相关基因cDNA的克隆与功能研究[D];河北师范大学;2005年
10 刘媛;三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郝言明;柔嫩艾美耳球虫两个抗药株消减cDNA文库的序列分析[D];福建农林大学;2010年
2 邓效禹;籽鹅垂体组织全长cDNA文库的构建及部分克隆序列分析[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
3 李付美;莱芜猪心脏组织cDNA文库的构建及部分表达序列标签的分析[D];曲阜师范大学;2010年
4 杜雯林;苹果褐斑病菌钙调素基因的cDNA克隆以及序列分析[D];西北农林科技大学;2010年
5 战晴晴;柴胡全长cDNA文库和遗传图谱的构建及蚕豆病毒属病毒的鉴定[D];东北林业大学;2010年
6 王金萍;枳根全长cDNA文库的构建及生物信息学研究[D];西南大学;2011年
7 刘磊;TMV侵染烟草基因差异表达的cDNA-AFLP分析[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
8 严福祥;乌龟孔雀石绿浸泡后的组织病理学研究及肝脏全长cDNA文库的构建与鉴定[D];暨南大学;2010年
9 杨朝霞;微小牛蜱雌蜱唾液腺消减cDNA文库的构建及卵黄蛋白原基因的原核表达[D];中国农业科学院;2010年
10 谢凯;嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA文库的构建及亲环蛋白基因的序列分析[D];南昌大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026