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《东南大学》 2017年
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微流控单细胞电阻检测系统的开发与实验研究

唐文来  
【摘要】:单细胞水平的生物物理特性表征,可有效阐明细胞的基本结构、功能信息及病理状态,揭示细胞间的个体差异性,对于细胞的种类鉴别与癌症等重大疾病的早期诊断等具有非常重要的意义。由于具有与细胞尺度相匹配的微米级通道,微流控芯片在细胞的微环境控制、运动调控及性能表征等方面具有得天独厚的优势。近年来,微流控已经发展成为一个涉及机械、电子、材料、流体、生物和医学等诸多学科的前沿技术,研究开发基于微流控技术的单细胞物理特性表征方法,有望成为新一代即时检测仪器的关键突破口。在回顾片上单细胞物理特性表征技术的最新研究现状与存在问题的基础上,本文开发了一套便携式的通用电阻抗测量系统,并先后研制出具有不同功能的微型库尔特计数器、阻抗流式细胞仪和微型阻抗分析仪,以期在全血中循环肿瘤细胞的鉴别、计数和状态监测等方面提供一套有益方法,取得下列创新性研究成果:(1)在细胞介电理论与阻抗测量方面:研究建立描述单细胞悬浮液系统介电特性的Maxwell混合模型与等效电路模型,并探索系统介电特性在时域和频率内的严格对应关系。在此基础上,提出一种基于伪随机m序列相关辨识原理获取细胞宽频阻抗谱的新方法,在极短的0.5115 ms内测得从1.953 KHz到1 MHz共512个频率下的细胞阻抗信息。编写LabVIEW同步采集程序,利用数据采集卡和电流放大器实现m序列激励信号的施加与响应信号的获取;开发MATLAB信号分析处理程序,对采集到的响应信号依次进行快速M变换和快速傅里叶变换得到交流阻抗信息。通过制作一个已知电学参数的RC测试电路,验证了基于伪随机m序列宽频阻抗测量技术的可靠性。由于激励信号的生成、响应信号的获取以及阻抗信号的分析处理等均通过软件编程实现,开发的电阻抗测量系统具有良好的便携性,且可通过调用相应的程序方便地实现细胞的直流或交流阻抗检测。(2)在肿瘤细胞直流阻抗检测方面:研制一种集成惯性聚焦技术与液体电极传感技术的微型库尔特计数器,旨在实现细胞的高通量计数、体积表征与种类鉴别。利用非对称弯流道内的微流体惯性效应将细胞稳定聚焦在特定的横向位置,保证了后续直流电阻抗测量的稳定性和准确性。通过向Ag/AgCl电极腔内填充高电导率溶液形成的液体电极结构缩短了检测区域的长度,有效提高了测得直流阻抗峰值对被测对象尺寸的灵敏度。通过测量标准的聚苯乙烯粒子先后对样品流量与电极腔补充液流量进行优化,并在测得阻抗峰值与粒子体积间建立了严格的线性关系,获得高达每秒5000个粒子的检测通量。将优化后的微型库尔特计数器用于人体乳腺癌细胞系MCF-7细胞和人体白细胞的测量,得到MCF-7细胞与白细胞的平均直径分别为14.28 μm和9.01 μm。最后,根据两种细胞直流阻抗峰值的统计结果,设定鉴别阈值并成功在混合细胞样品中识别出MCF-7细胞。(3)在肿瘤细胞交流阻抗检测方面:研制一种集成粘弹性聚焦技术与宽频阻抗测量技术的阻抗流式细胞仪,旨在实现细胞的连续交流阻抗检测与种类鉴别。利用方形直流道内PEO溶液的惯性效应与粘弹性效应将细胞规则排列于流道的中心,并通过微流道底部的ITO平面电极将开发的宽频阻抗测量技术用于分析流动态细胞的交流阻抗信息(幅值和相位角)。通过比较有无聚焦单元两种情况下测得的粒子阻抗信号验证了粘弹性聚焦预处理的必要性,并系统研究了不同样品流速下MCF-7细胞在方形直流内的粘弹性聚焦行为。随后,分析不同频率下粒子通过检测区域时引起的阻抗变化情况,确定交流阻抗信号分析的最佳频率,并在此基础上探索了流道尺寸与样品流速对粒子阻抗测量的影响。最后,将提出的阻抗流式细胞仪用于MCF-7细胞和白细胞的检测,根据测得的阻抗峰值统计结果设定鉴别阈值,成功在混合细胞样品中鉴别出MCF-7细胞。(4)在肿瘤细胞状态监测方面:研制一种集成流体动力学捕获技术与宽频阻抗测量技术的微型阻抗分析仪,旨在实现肿瘤细胞的自动捕获与状态监测。设计蛇形流道捕获阵列,基于最小流阻路径原理实现细胞的确定性、自动化捕获,并通过与捕获单元对应的ITO电极阵列,将开发的宽频阻抗测量技术用于捕获细胞的状态监测。制作三种具有不同蛇形流道结构的微流控芯片,系统研究了 MCF-7细胞在微流道内的流体动力学捕获行为,获得高于95%的细胞捕获率。通过分析MCF-7细胞在不同捕获状态下测得的全频阻抗谱,确定区分细胞状态的最佳频率范围。最后,将开发的微型阻抗分析仪依次用于单个和多个MCF-7细胞运动状态的监测,成功获取了细胞在捕获过程中的位置、速度、方向以及数量等信息。
【学位授予单位】:东南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TH77

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【参考文献】
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