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《东南大学》 2018年
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血液测序样本准备方案的建立及其在肝癌相关研究中的应用

沈彦婷  
【摘要】:下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)是目前最为常用的高通量测序技术。其操作步骤相对复杂,每一个步骤都可能因误差甚至错误而导致最终测序结果的不一致,因此,对NGS的操作流程进行研究,使其稳定、规范对于其进一步的临床推广至关重要。NGS的检测流程可分为样品准备、上机测序以及生物信息分析三个关键环节,其中,样品准备是绝大部分科研与医疗单位主要承担的环节。血液样本相较于组织样本具备创伤风险小、患者依从性高、价格便宜、易于获得等优点,是最为理想的测序样本类型。鉴于此,该论文以血液样本为主要研究对象,对测序样本准备方案进行优化研究,使其更稳定与规范以减少不同测序平台间的差异,并将其应用到肝癌基因表达谱的研究中;同时还建立了一种样本测序模板准备新技术,为进一步提高测序效率打下了基础。本文的主要工作如下:一、血液测序样本储存方案的建立血液样本的储存既是样品准备环节的第一步,又是NGS检测的第一步,决定着核酸的质量,尤其是影响着RNA的完整性。目前,适用于RNA提取的血液样本的转移或临床工作短期储存方案的相关研究极少。本研究第二章节对适用于RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)的血液样本的短期储存方案进行研究,系统分析了不同储存时间的血液样本、不同RIN的RNA样本的表达谱差异。研究结果显示:4℃存放7天内的血液中提取的RNA完整性系数(RNA integrity number,RIN)在5.3~9.0范围内的RNA样本胡基因表达谱无显著差异。二、基于DNA呼吸作用的等温乳液扩增方案的建立单分子多拷贝的制备是NGS文库制备最为关键的环节之一,目前仍然依赖于PCR为基础的扩增技术,其中乳液PCR(emulsion PCR,emPCR)应用的最为广泛,但是其仍然存在着一些技术缺陷以致emPCR的稳定性和扩增效率较差。目前,由热循环引起的乳液体系稳定性下降是emPCR的关键技术瓶颈。针对这一技术难题,本研究第三章节将DNA呼吸作用运用到乳液扩增中,建立基于DNA呼吸作用的等温乳液扩增方案(breathing-based isothermal emulsion amplification,BIEA),并对其接头序列、反应温度、反应时间、反应温控设备以及包被磁珠的引物的修饰基团进行优化。最后还利用高通量测序平台对其单分子(单克隆比例)扩增效率进行质量控制分析(quality control,QC)。研究表明,基于DNA呼吸作用的乳液等温扩增方案具有稳定乳液体系、简化温控设备以及降低实验投入等优点,为高通量测序、数字PCR、生物芯片等相关技术的进一步发展提供了坚实的基础。三、PBMCs中基因差异性表达与肝癌的相关性分析血液中的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)不仅可以反映肿瘤患者机体的细胞免疫功能从而有效地监管肿瘤的发展,而且在降低肿瘤异质性方面具备优势,是癌症基因表达谱分析相关研究的最佳样本类型。本研究第四章节将第二章节制定的血液储存方案应用到肝癌的研究中,对符合RIN值安全范围的肝癌患者的PBMCs中的RNA依次进行测序、差异性表达基因(differential expression gene,DEG)分析以及RT-qPCR验证。结果表明,本研究筛选出了5个肝癌转移基因诊断的候选指标,并且发现DEGs的个数和IL1B的表达水平具有监管肝癌病程发展的潜能。综上所述,本研究所建立的血液储存方案与BIEA将有助于稳定与规范NGS的样品准备环节,从而降低不同测序平台间测序结果的不一致性。其次,在此基础上,本研究以容易获得、微创的PBMCs样本为实验材料,识别了5个DEGs,其有望成为肝癌转移基因诊断的候选指标,并且发现DEGs的个数和IL1B的表达水平具有监管肝癌病程发展的潜能。该部分研究结果将有助于为以后的临床诊断与治疗等方面的研究提供新的视角。
【学位授予单位】:东南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R735.7;R440

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