地龙2号抑制实验性大鼠肝纤维化的基础研究

【摘要】：【目的】研究地龙2号抑制大鼠肝纤维化的作用并探讨其可能的机制。 【方法】雄性Wistar大鼠52只,随机分成6组:正常组(N组,6只):不做药物处理;阴性对照组(NC组,6只):皮下注射花生油,2ml/kg,2次/wk,单蒸水灌胃,10ml/kg/d;模型组(M组,10只):皮下注射40%CCl4(首剂为75%)花生油混合液,2 ml/kg,2次/wk,单蒸水灌胃,10ml/kg/d;阳性对照组(PC组,10只),造模同时,给予秋水仙碱灌胃,0.1 mg/kg/d;地龙2号大剂量组(E h组,10只):造模同时用地龙2号灌胃,50 mg/kg/d;地龙2号小剂量组(E l组,10只):造模同时用地龙2号灌胃,25 mg/kg/d。8周末处存活死大鼠。实验分为两部分:一是地龙2号抑制大鼠肝纤维化的疗效实验,二是机制探讨实验。疗效实验包括:取血测血清ALT、AST及AST/ALT,放射免疫法检测血清透明质酸(HA)和层粘连蛋白(LN),取肝组织作HE染色进行肝纤维化程度分级。机制探讨实验包括:用免疫组化的方法检测大鼠肝组织中uPA、PAI-1、α-SMA、TGF-β1 、MMP-13、TIMP-1的蛋白表达,用RT-PCR的方法检测大鼠肝组织中TGF-β1 、MMP-13及TIMP-1 mRNA的表达。 【结果】与M组相比,E h组和E l组HE染色肝纤维化程度明显减轻(分别为P0.05,P0.01),AST/ALT比值(分别为P0.05,P0.01)、LN和HA(P0.01)也显著降低。免疫组化结果表明:与M组相比,E h和E l组uPA(P0.05)、PAI-1(P0.05)、TGF-β1 (P0.01)、α-SMA(P0.01)及TIMP-1(P0.01)蛋白表达显著降低,而MMP-13(分别为P0.05和P0.01)则升高;M组肝纤维化程度与uPA、PAI-1、TGF-β1、α-SMA及TIMP-1表达、uPA、PAI-1、TGF-β1、α-SMA、TIMP-1五者表达均呈正相关;E h组肝纤维化程度与PAI-1、TGF-β1、α-SMA的表达、uPA、PAI-1、TGF-β1、α-SMA四者表达均呈正相关;E l组肝纤维化程度与uPA、PAI-1、TGF-β1、α-SMA、MMP-13、TIMP-1表达、uPA、PAI-1、TGF-β1、α-SMA、TIMP-1四者表达、MMP-13与PAI-1两者表达呈正相关。RT-PCR结果显示:与M组相比,E h和E l组TGF-β1(E l组P0.05)和TIMP-1 mRNA(P0.01)表达均明显下降,而MMP-13 mRNA(P0.01)则升高,且MMP-13/TIMP-1(P0.01)mRNA比值显著升高。 【结论】地龙2号,尤其是小剂量者,对大鼠肝纤维化具有明显的抑制作用。其机制可能是:①地龙2号抑制了HSC的活化,使α-SMA表达下降,TGF-β1的分泌减少,致肝纤维化因子释放减少,ECM合成下降,减轻肝纤维化的程度;②地龙2号含有的蚯蚓纤溶酶及蚯蚓胶原酶可能直接降解ECM,从而减轻和延缓肝纤维化的发生;③地龙2号降解ECM的作用大于TGF-β1致纤维化的作用,使肝纤维化程度减轻;④不能排除补充外源性的纤溶酶对uPA起负反馈调节的可能性;⑤MMPs的升高可能与PAI-1及TIMP-1的降低有关,从而对MMPs的抑制减轻,促进ECM的降解;⑥地龙2号可以逆转肝纤维时MMP-13/TIMP-1mRNA基因表达的不平衡,使其比值升高,促进ECM的降解。