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基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量SNP检测芯片的研究及应用

孙蓓丽  
【摘要】: 随着人类基因组序列的绘制完成,生命科学领域的研究热点正迅速转向对基因功能、表达调控、多个基因间以及基因和环境间相互作用等方面。对基因组序列中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的研究是该阶段的重要研究内容之一。SNP作为第三代遗传标记,具有数量多、密度大、分布广等特点,可用于疾病基因的定位与克隆、关联分析等,并在疾病的早期诊断、预防和治疗等方面体现重要功能和应用价值。 SNP的分型检测技术种类繁多,各有利弊,探索和建立准确、快速、高通量的SNP检测方法仍然十分必要。DNA微阵列由于其平行性、高通量检测等特点,在SNP分型上有很大的优势。基于DNA微阵列的SNP分型技术有两种:一是将寡聚核苷酸固定在基片上检测靶DNA中多个SNP位点;一是将靶DNA固定在基片上检测大量样本的某些特定位点。本论文在对第二种SNP检测技术进行优化的基础上,提出了一种新型的基于三维凝胶载体的DNA微阵列检测SNP的分型技术,并将其应用于冠心病易感基因的研究中,主要内容如下: 1.基于二维DNA微阵列的SNP检测技术的优化 比较氨基、醛基、多聚赖氨酸三种不同玻片修饰方法,以及不同PCR产物长度的固定、杂交效率,结果表明,采用醛基修饰的玻片上固定200bp左右的PCR产物,具有较高的固定、杂交效率和信噪比。但这种二维DNA微阵列对PCR产物的需求量大,固-液相反应效率较低,用于高通量SNP检测还存在灵敏度、重复性、稳定性等多方面的不足。 2.基于三维凝胶的SNP检测芯片的制备与优化 与传统的二维核酸微阵列相比,凝胶DNA微阵列特有的三维网状结构可以固定更多的核酸分子,水凝胶载体提供类似于液相的反应环境,可以作为良好的核酸固定载体进行SNP检测。我们采用将丙烯酰胺修饰的PCR产物与丙烯酰胺单体等混合,点样于玻片上,在充满TEMED的真空干燥器内聚合成聚丙烯酰胺凝胶,制备三维凝胶的DNA微阵列。与分别标记Cy3、Cy5的荧光探针杂交,通过电泳清除非特异性键合,可有效识别单碱基错配。通过进一步对聚丙烯酰胺凝胶浓度、产物变性方法、探针长度、电泳条件等进行了一系列优化,以及通用标签探针的应用,建立了一种新型的基于三维凝胶DNA微阵列的SNP检测技术,具有比二维芯片更理想的准确性、灵敏度、稳定性和重复性,并极大地降低了SNP检测成本。 3.基于凝胶的SNP检测技术应用于冠心病易感基因的研究 利用生物信息学筛选功能性SNPs,并应用于冠心病研究中。我们初步筛选出了OLR1、MMP-1、MMP-13、MMP-11、MMP-27和MMP-L1等6个基因的7个SNPs位点用于冠心病易感基因的研究。基于三维聚丙烯酰胺凝胶DNA微阵列技术,我们对238例冠心病患者和233例正常对照进行SNPs分型检测,并采用case-control方法进行统计和遗传学分析。结果显示:将病人组按照生化指标是否异常分组,在HDL 1.55 mmol/L和HDL≥1.55 mmol/L的女性冠心病人组间、LDL≥3.12 mmol/L


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