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《江苏科技大学》 2011年
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稳定表达不同动物犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立

闫如勋  
【摘要】:犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)病毒引起的一种高度接触性传染病。该病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的传染病病之一,可引起大批犬、貂、狐等动物发病,发病死亡率为30~80%,雪貂高达100%。病毒分离技术是对CDV特性的研究的重要手段,但具有囊膜的CDV不易在环境中存活,因此难以用普通方法分离成功,限制其对CDV的研究。 信号淋巴细胞激活分子(Signaling Lymphocyte Activation Molecule, SLAM)是CDV感染宿主的主要受体,本文旨在建立稳定表达不同动物(犬、狐狸、貉和水貂)SLAM的Vero细胞系,用于CDV分离和体外研究。用PCR的方法以克隆有犬、狐狸、貉和水貂SLAM的pMD18-T (分别命名pMD18-T-cSLAM、pMD18-T-fSLAM、pMD18-T-rSLAM和pMD18-T-mSLAM)为模板扩增目的基因片段,将其定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到重组表达载体pIRES2-EGFP-cSLAMh、pIRES2-EGFP-fSLAMh和pIRES2-EGFP-mSLAMh。将空载体和已构建完成的重组表达载体分别用脂质体法转染到Vero细胞,通过G418和EGFP筛选稳定表达的阳性Vero细胞。用免疫组化的方法证实SLAM在传了6代转染重组质粒的细胞内的表达。成功建立了稳定表达动物(犬、狐狸、貉和水貂)SLAM的Vero细胞系,分别命名为V-p-cSLAMh、V-p-fSLAMh、V-p-rSLAMh和V-p-mSLAMh细胞系。对建立的V-p-rSLAMh细胞系进行稳定性、病毒分离敏感性和分离CDV毒力评价。6次冻存复苏的V-p-rSLAMh细胞生长良好,说明细胞稳定性良好。将V-p-rSLAMh细胞系和Vero细胞分别接种3份CD阳性样品,接种3份样品后的细胞系在接毒36~48h形成典型的细胞病变(cytopathic effect, CPE),而在Vero细胞连续盲传6代未见犬瘟热病毒典型CPE,可见建立的细胞系在分离CDV方面比Vero细胞敏感。以V-p-rSLAMh细胞系分离到的LN((10)f1株CDV进行貉和狐狸攻毒实验,每只的攻毒剂量为4×10~(2.39) TCID_(50)/只,攻毒组3只貉和狐狸在11~22d死亡,正常对照组貉和狐狸健康存活,说明分离的CDV LN(10)f1株具有较强毒力。H基因序列分析表明该CDV强毒属于Asia-1基因型。 稳定表达SLAM的细胞系的建立为CDV的研究提供了一个有效的操作平台,同时也为CDV强毒株的获得提供保障。
【学位授予单位】:江苏科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S855.3

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【参考文献】
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