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《江苏科技大学》 2019年
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家蚕山梨醇脱氢酶基因与蜕皮激素合成途径基因Shadow的功能研究

朱娟  
【摘要】:家蚕(Bombyx mori)是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物。滞育和变态发育是家蚕重要的特性,其分子机制的研究一直是蚕业科学领域的难点和热点,迄今仍未完全阐明。家蚕是典型的卵滞育昆虫,根据其在自然条件下1年发生的世代数可分为一化性、二化性和多化性,根据幼虫期眠或蜕皮的次数又可分为三眠蚕、四眠蚕和五眠蚕。为深入了解家蚕山梨醇脱氢酶基因BmSDH的特性、蜕皮激素合成途径(Ecdysteroidogenic Pathway,EP)Shadow基因在滞育和变态发育中的作用,本文以家蚕二化性品种秋丰为材料,利用5’RACE、qRT-PCR和CRISPR/Cas9等技术,研究BmSDH与Shadow基因的功能,取得以下主要结果。1.家蚕山梨醇脱氢酶基因的转录起始位点确定及启动子结构分析。用5′RACE技术确定BmSDH基因的转录起始位点;利用NNPP、JASPAR、Alibaba2.1等在线软件对转录起始位点上游2 kb及下游200 bp序列进行分析。结果表明,BmSDH-1的转录起始位点为A(-41),BmSDH-2a的转录起始位点为C(-41),BmSDH-2b的转录起始位点为A(-40)(翻译起始位点为+1);预测到核心启动子区和转录因子结合位点多集中在近1 kb序列区;在这3个基因转录起始位点上游25-30 bp处均未找到TATA框,其与典型的真核生物启动子序列结构不同。2.家蚕山梨醇脱氢酶基因启动子特性及不同激素对BmSDH-2a的调控分析。分别克隆BmSDH-1,-2a,-2b基因约1 kb及BmSDH-2a不同片段的启动子区序列,构建带有萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-BmSDH-P-luc,与pRL-CMV报告质粒(含海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕Bm N细胞,分别在培养基中添加昆虫保幼激素、蜕皮激素以及滞育激素;通过双荧光素酶报告系统检测BmSDH启动子活性以及不同激素处理对BmSDH-2a基因启动子活性的影响。结果显示,BmSDH-2a启动子活性极显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子;BmSDH-2a 355 bp长度片段的启动子转录活性极显著高于674 bp和1 117 bp长度片段。用滞育激素处理时,BmSDH-2a 1 117 bp启动子活性随着激素浓度的升高有上升的趋势,当浓度高于100 ng/mL时启动子活性有所降低但仍保持在较高水平;用保幼激素进行处理时,随着激素浓度的升高启动子活性逐渐降低;蜕皮激素处理时,100 pg/mL激素显著增强启动子活性,当激素浓度继续升高时启动子活性逐渐降低。3.蜕皮激素合成途径基因在二化性家蚕蛹初期的表达特性分析。已有研究显示蜕皮激素参与家蚕胚胎滞育的调节,但其分子机制尚未清晰。为探索蜕皮激素合成通路基因在家蚕滞育过程中的作用,以二化性家蚕秋丰为材料,依据二化性家蚕子代卵滞育性受亲代催青环境调控的特点,通过控制催青条件分别建立滞育诱导组(diapause eggs producers,DEPs)和非滞育诱导组(non-diapause eggs producers,NDEPs)。在蛹期分析蜕皮激素通路基因在两组间的表达差异。结果显示:Neverland、Spook和Cyp18a1在DEPs组上调表达,Phanton和Shade基因在两组间的表达水平无显著差异,Disembodied和Shadow基因则在NDEPs组上调表达。在NDEPs蛹期第3天卵巢组织中,Shadow的表达显著增加并达到峰值,由于此时期滞育激素也大量分泌,推测Shadow与滞育高度相关。为了验证这一假设,在NDEPs蛹期第2天对Shadow基因进行RNA干涉,48 h后检测到Shadow的表达水平显著下降;蜕皮激素通路下游基因βFtz-F1表达水平显著降低;编码犬尿氨酸合成酶基因在卵巢组织中的表达显著上调;与Shadow,犬尿氨酸合成酶基因均存在关联的Brown,AdenoK在脂肪体中显著上调表达。产卵后48 h,经dsShadow干涉的子代卵部分呈现浅紫色,表现出一定滞育倾向。上述结果表明对Shadow抑制可上调3-羟犬尿氨酸合成酶基因的表达。此外,克隆了Shadow基因的ORF并成功在E.coil中表达,为进一步研究Shadow蛋白的功能建立基础。4.基于CRISPR/Cas9技术的Shadow基因功能研究。联合CRISPR/Cas9基因编辑系统和显微注射技术对Shadow基因进行敲除,以进一步研究家蚕Shadow基因的功能。首先在BmN细胞中筛选具切割活性的gRNA靶位点,对NDEPs产下的非滞育卵显微注射gRNA与Cas9混合物,待孵化后对蚕蛾进行编号,常规饲养至交配产下G_1代,对G_0代个体提取基因组检测突变情况。结果在G_0代检测到1头嵌合体,G_2代筛选出突变纯合体,该突变纯合体1龄期发育正常,能按时就眠;2龄将眠初期蚕体有光泽,但进食量少,维持该阶段6-8日,仍然不蜕皮,不能正常进入3龄期,最后能量耗尽陆续死亡。该突变体检测结果显示在第3外显子上缺失42个碱基,对其转录水平进行分析,发现Shadow在mRNA水平上的表达极显著低于对照组,推测由于突变体内Shadow基因的低表达导致突变体2龄不眠。对突变家蚕添食20-E,发现添食20-E后突变体蚕顺利进入3龄,说明家蚕体内20-E合成不足是出现2龄不眠蚕的主要原因。实验表明Shadow基因是家蚕蜕皮激素合成途径中的重要基因。通过上述分析,我们确定了家蚕BmSDH-1,-2a,-2b基因的转录起始位点,BmSDH-2a的表达受蜕皮激素影响;在家蚕NDEPs组蛹期第3天发现存在蜕皮激素的积累,对Shadow基因干涉能上调家蚕犬尿氨酸合成途径,推测BmShadow基因参与家蚕滞育过程的调节;最后成功利用CRISPR/Cas9系统在家蚕“秋丰”品种中敲除BmShadow基因,并筛选出突变纯合体;为进一步阐述家蚕的滞育准备期调控机制提供了实验基础。
【学位授予单位】:江苏科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S881.26

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