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5’-核苷酸制备工艺的研究

徐燚  
【摘要】: 5’—核苷酸在农业、食品行业和医药行业上有着广泛的用途。尤其是在婴儿食品和医药领域的应用中,有着不可替代的功能。在婴儿食品中,作为婴儿食品的添加剂可以明显提高婴儿的免疫能力,促进肠道的成熟,促进脂蛋白和多不饱和脂肪酸的合成,减少婴儿感冒和腹泻等疾病的发生,有利于婴儿的正常生长和发育。作为医药中间体,核苷酸可以合成许多抗病毒、抗肿瘤药物,其相应的衍生物在治疗中枢神经系统、循环系统和泌尿系统等方面疾病有很重要的作用。国内目前能进行四种核苷酸生产的仅为个别厂家,且产品纯度不高,产量不大,不能满足日新月异的核苷酸衍生物的开发研究。原料不足的这一问题严重制约了我国核酸类药物和衍生物的开发。 除在医药行业应用外,在精细化工及食品行业中核酸类物质也有重要作用。核酸类物质作为化妆品的成分之一,有护肤、防皱等功效。其无毒、无刺激性以及生物活性有利于人体的健康。核酸类物质用做植物营养添加剂,使用后可以明显提高水稻、大豆等农作物的产量,最高增产可以达40%。用于动物的饲养可以提高动物的增重率及饲料使用率,料耗明显降低。在生物化学领域,新的核酸类物质,如新型的寡聚核苷酸的出现,可以作为靶细胞的探针用于研究基因的功能、相关的遗传座位和基因组文库作图等方面,甚至用于相应抗癌制剂的作用机理研究,为分子生物学研究提供了新的方法和手段。因此,原料核苷酸的短缺,不但严重影响到我国医药产业的快速发展,而且对于我国精细化工和生物化工行业也有着不可低估的影响。 本文从大规模工业化生产四种核苷酸角度出发,利用成本低廉的酶解法生产四种5’-核苷酸。从原始菌株出发,经过自己诱变筛选,得到一株核酸酶P1的高产菌株。工业化大规模生产时,酶蛋白表达十分稳定。在发酵方面,首次使用了新型的气升式反应器进行大规模的发酵生产,不但克服了以往固体发酵环境污染严重的弊端,而且同传统的搅拌式反应器相比,有着发酵周期短、产酶高的特点。利用气升式反应器发酵生产的核酸酶P1的酶活可以达到1000u/mL,高于文献报道的700u/mL的水平。与搅拌式反应器发酵90小时相比,发酵时间缩短为63小时,有利于工业化生产。同时,首次模拟了在气升式反应器中桔青霉菌体的生长和产酶的动力学模型,为进一步调控菌体的生长和产酶提供了一定的理论基础。 本文利用酶解法生产四种5’-核苷酸。在酶解反应过程中进行了调控,加上对粗酶液采取了一定的预处理方法,从而部分解决了原生产中存在的高浓度底物抑制问题。目前,我们可以直接使用底物浓度为5%的核酸液进行酶解,远高于国内的1%的底物浓度水平。同时,酶解率达90%以上,高于目前国内厂家70%~ 摘要 85%的酶解率。酶解反应完成后所得到的四种核普酸混合液中杂质较少,为进一 步分离纯化提供了良好的基础。本文同时首次建立了核酸酶Pl酶解的速率模型。 在目前国内树脂不能一次同时分离四种核营酸的前提下,本文针对四种核昔 酸分离的复杂性,首次提出了分步分离的策略。即先做到四种核普酸的初步分离, 然后再进行进一步的纯化分离操作。由于没有可以一次将四种核昔酸初步分离开 的分离介质,本文根据四种核昔酸的解离特性,首次自行合成了一种阳离子交换 树脂,可以用于四种核普酸的初步分离。该树脂不但具有对四种核普酸较大的吸 附容量,而且对四种物质的分离度也较高,分离效果较好。利用该阳离子交换树 脂初步分离的收率分别为:尿营酸(UMP)收率在85%左右,纯度为70一85%; 鸟昔酸(GMP)和胞昔酸(CMP)收率在92%左右,两者纯度均在90%以上; 腺昔酸(AMP)的收率在90%左右,纯度在90%以上。利用色谱中的分离度概 念考察离子交换树脂对四种核营酸分离效果,UMP与GMP之间的分离度为1 .n, GMP与CMP之间的分离度为1 .87,CMP与AMP之间的分离度为1 .84。分离度 的数据也表明,四种核营酸之间可以做到初步分离。 本文还利用自行合成的不同种类的树脂,对初步分离得到的四种核营酸的收 集液进行了筛选。找出选择性高、交换容量大的离子交换树脂进行每种核普酸的 进一步分离纯化。并利用吸附容量和分离因数两方面考察离子交换树脂对某一种 核昔酸的选择性,对树脂的筛选具有良好的理论指导意义。在进一步纯化分离中, 以UMP的分离为代表,筛选到合适的阴离子交换树脂SD3,吸附容量为 o.o69gUMp/g树脂,分离因数为0.7。吸附UMp时,吸附等温线的f’(C)o,是 属于有利于吸附平衡的情况。因此,SD3阴离子交换树脂适合于UMP的分离纯 化。此外,本文还研究了尿营酸在新合成的离子交换树脂上的动力学吸附过程, 描述了尿昔酸浓度变化与吸附动力学之间的关系。当UMP溶液浓度为29几时, UMP与弱碱性阴离子交换树脂上的交换速率主要是受液膜扩散控制,而当浓度 升高时,液膜扩散影响逐渐减小。当浓度达到10g/L时,交换速率则转变为受颗 粒扩散控制为主,这些均未见报道。 本文还研究了不同工艺条件对核营酸结晶的影响,主要是以难结晶的尿普酸 为例,在考察了多种操作条件对尿昔酸结晶影响的同时,我们从溶解度和过饱和


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