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高脂膳食性氧化应激对淋巴细胞功能抑制机制的研究

崔珏  
【摘要】: 由于生活水平的提高,膳食结构改变,高能量密度膳食摄入比例逐步增加。能量摄入的增加,体内能量代谢增强,其副产物ROS生成也随之增多,诱发机体形成氧化应激。研究发现高能膳食可降低机体的免疫功能,导致病毒感染和癌症的发病率逐年增高。由于高脂食物摄入比例增高导致的机体ROS生成的增加,可能是影响淋巴细胞的基因表达模式和功能状态的主要原因。目前,还少有研究报道膳食性氧化应激抑制淋巴细胞功能的内在产生机制。本文旨在探讨高脂膳食性氧化应激对淋巴细胞能量和功能状态影响的分子机制,以及抗氧化剂硫辛酸通过清除ROS,改变机体的氧化还原状态对淋巴细胞功能障碍的干预作用。 1.高脂膳食性氧化应激对淋巴细胞功能和数量的影响? 通过检测外周血、空肠、胸腺和脾脏的氧化还原指标,研究长期高脂膳食对免疫组织氧化还原状态的影响。C57BL/6雄性小鼠随机分为3组:对照组(2%猪油);高脂组(HFD,19.5%猪油);硫辛酸干预组(HFD+0.1%LA),喂饲10周。结果显示长期高脂膳食使免疫组织内的抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性显著降低,伴随ROS和脂质过氧化物MDA含量显著升高,导致细胞内的TAC能力减弱,GSH/GSSG比值显著降低。结果说明长期高脂膳食使免疫组织内的ROS生成与清除的动态平衡被破坏,形成氧化应激。抗氧化剂硫辛酸通过清除ROS、提高抗氧化酶的活力可有效改善免疫组织内的氧化还原失衡的状态。通过检测外周血和脾脏内CD4+/CD8+T细胞亚群比值、B细胞百分含量、淋巴细胞凋亡率、淋巴细胞转化率、以及血浆中促炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和抑炎性细胞因子IL-4、IL-10的含量,探讨长期膳食性氧化应激对淋巴细胞数量和功能状态的影响。结果表明高脂膳食性氧化应激可显著抑制淋巴细胞的功能表现为淋巴细胞转化率、CD4+/CD8+比值和B细胞的百分含量显著降低,同时淋巴细胞凋亡率显著升高。此外,HFD组小鼠血浆中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量显著高于对照组,而IL-4、IL-10的含量显著低于对照组,说明高脂膳食性氧化应激可导致促炎性与抑炎性细胞因子分泌失衡,诱发机体形成慢性炎症。硫辛酸通过清除ROS,恢复氧化还原平衡,缓解机体的慢性炎症状态,从而改善淋巴细胞的功能。 2.高脂膳食性氧化应激对淋巴细胞功能抑制的分子机制 从基因的转录水平全面分析由高脂膳食介导的淋巴细胞功能障碍的分子机制。利用affymetrix MOE430A基因芯片分析长期高脂膳食和LA干预对脾脏基因表达模式的影响,并使用On-tools在线分析软件同时结合KEGG基因网络数据库分析了显著改变的基因通路。芯片结果显示,长期高脂膳食导致细胞生理过程(包括MAPK、细胞周期、凋亡、细胞骨架、细胞紧密连接、胰岛素信号等),淋巴细胞功能(包括TCR、BCR、细胞因子受体)和固有免疫功能(包括Toll样受体、自然杀伤细胞调节的细胞毒性),以及抗氧化防御体系等多个通路中相关基因的表达发生显著改变,多数呈下调趋势。通路分析结果提示,长期高脂膳食可通过抑制胰岛素信号转导,降低淋巴细胞内能量生成,从而减弱淋巴细胞受体的信号传递。同时通过上调促凋亡基因(Dffb、Fadd),下调抗凋亡基因(Arhgdig、Bcl2l15)的表达使淋巴细胞的数量显著减少。LA通过清除ROS,恢复具有抗氧化功能的酶或蛋白的基因表达水平,缓解膳食性氧化应激对机体造成的氧化损伤,并通过下调凋亡信号通路中相关基因的表达和恢复免疫反应和能量代谢相关基因表达,改善免疫细胞的功能。 通过检测肠道中分泌型免疫球蛋白SIgA的分泌水平,同时利用基因芯片检测空肠派伊尔结与抗氧化防御体系、TCR、BCR、抗原提呈信号通路中相关基因的表达水平,探讨膳食性氧化应激对肠道黏膜免疫功能抑制作用的分子机制。研究结果显示,高脂膳食可显著下调空肠派伊尔结内包括抗氧化防御体系、TCR(包括Il2ra、Syk、Lck、Cd28、Cd86)、BCR(包括Cd19、Cr2、Ighg、Igh-6、Cd79b)、抗原提呈(包括H2-Oa、H2-M3)信号通路中多个基因的表达。同时肠道内SIgA的分泌水平显著降低也证明了高脂膳食性氧化应激可抑制派伊尔结内淋巴细胞的抗原提呈和抗体的分泌功能。LA干预可通过清除ROS、改善氧化还原平衡状态而有效地保护肠道粘膜免疫功能。 3.高脂膳食性氧化应激对脾脏蛋白表达的影响 通过使用比较蛋白质组的研究方法从蛋白的表达水平进一步探讨由高脂膳食导致的淋巴细胞功能障碍的分子机制。双向电泳分析结果显示,与对照组相比,共有20个蛋白点表达变化显著(Fc3)。MALDI-TOF MS鉴定结果显示,这些表达显著变化的蛋白在包括细胞能量和物质代谢(ACO2、TKT)、氧化应激(PRDX1)、细胞骨架(CORONIN、VIM)、细胞凋亡(HLX、DAPK1)、细胞周期(CITRON-K、GPRIN1)等多种细胞功能中具有重要的作用。LA通过清除ROS、上调抗氧化蛋白PRDX的表达水平,恢复胞内氧化还原平衡,可增强细胞内能量代谢和生物大分子合成。 4.淋巴细胞的氧化还原状态对其效应功能及能量水平的影响 通过研究不同周期高脂膳食对脾脏淋巴细胞内ATP水平、线粒体功能和淋巴细胞效应功能的影响,从细胞水平进一步验证高脂膳食介导的淋巴细胞功能障碍的产生机制。结果显示3周高脂膳食使T、B细胞内的ATP水平和转化率显著升高。而随着高脂膳食周期延长,淋巴细胞的转化率和ATP水平显著降低,同时胞内H2O2和MDA水平显著升高,伴随GSH/GSSG比值和线粒体膜电位降低,说明高脂膳食可影响淋巴细胞内氧化还原状态,并影响线粒体的功能。LA通过清除ROS,保护线粒体免受氧化损伤,使其在高能量代谢的环境中维持正常的生理功能。实时荧光定量PCR结果显示高脂膳食可显著改变淋巴细胞内与抗氧化防御体系(Mt-1、Prdx1、Prdx4)、T细胞增殖(Il2、Ilr2α)、BCR (CD19、Igh-6)以及糖吸收、转运和代谢(Inr、Slc2、Pik3cd、Akt3、Rac-1)相关基因的表达。随着高脂膳食的周期延长,淋巴细胞内与糖代谢、抗氧化防御和免疫功能相关的基因表达均呈下调趋势,说明淋巴细胞内氧化应激态可反馈抑制ATP生成,影响其功能。LA通过清除ROS,在高水平能量代谢的环境中保持淋巴细胞内氧化还原平衡,保护免疫细胞正常行使功能。 综上所述,高脂膳食性氧化应激导致的细胞内糖代谢抑制和ATP水平降低是淋巴细胞的数量减少和功能障碍的重要原因。抗氧化剂LA通过改变细胞的氧化还原状态,可有效地保护淋巴细胞功能。


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