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《江南大学》 2010年
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牛蒡功能性成分及其抗氧化、抗菌活性研究

娄在祥  
【摘要】: 本论文以牛蒡为原料,对牛蒡叶有效成分与牛蒡根菊糖的提取、分离及其活性进行了相关研究。为牛蒡综合深度加工利用提供了科学依据。具体研究内容及结果如下: 1.牛蒡叶、根有效成分提取分离研究 采用超声微波协同萃取技术提取多酚成分,发现提取时间、微波功率、料液比、提取次数对多酚提取有显著影响,分析得出了较佳提取条件为:以质量分数为70%的乙醇溶液为溶剂,提取时间30s,微波功率500w,超声波功率50w,料液比1g:20mL,提取次数为2次。在此条件下,多酚平均得率为10.28 mg/g,总提取物平均得率为232.79mg/g (牛蒡叶,干重)。通过扫描电镜观察发现,在超声微波协同萃取过程中,样品的微观结构被明显破坏,从而大大提高了多酚得率,加快了提取速度,取得最高得率所需的提取时间比超声波辅助提取和加热搅拌提取分别缩短了29.5min和5h。因此超声微波协同萃取技术在工业化提取多酚方面具有很大潜力,超声微波协同萃取为植物中多酚化合物的分析与鉴定提供了一种新的样品制备技术。采用超声微波协同萃取技术从牛蒡根中提取菊糖。分析得出了较佳提取条件为:以水为溶剂,提取时间60s,微波功率400w,料液比1g:15mL,菊糖平均得率为99.03 mg/g。结果表明,超声微波协同萃取处理破坏了样品的微观结构,因此与超声波辅助提取、加热搅拌提取相比,取得最高得率的提取时间分别显著缩短了120s与240s,提高了提取效率。 采用二级超滤对菊糖提取液进行纯化处理,确定了较佳操作条件为:一级超滤膜截留分子量为10KD,超滤压力为0.5MPa,二级超滤膜为0.5KD,超滤压力为1.0MPa。提取液经过两级超滤处理后,制备了高纯度菊糖产品,为白色粉末,纯度达91.3%。将牛蒡叶总提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水分别萃取,得到四个组分,分别命名为PF、EF、BF、WF。乙酸乙酯组分经柱层析预处理后,再通过高速逆流色谱制备了对香豆酸与绿原酸,纯度分别为98.8%与98.3%,并通过UV、ESI-MS、1H-NMR与13C-NMR等波谱分析方法进行了鉴定。 2.牛蒡叶成分的分析鉴定及5种主要成分同时检测方法的建立 利用UPLC-MS/MS技术,通过与标准品比较保留时间、紫外光谱、质谱等,并进行分析,鉴定了牛蒡叶的十一种成分。这些化合物是槲皮素、二咖啡酰奎尼酸、苯甲酸、槲皮苷、咖啡酸、木犀草素、绿原酸、水杨酸、对香豆酸、牛蒡子苷、芦丁等。其中,水杨酸、对香豆酸、苯甲酸是在牛蒡叶中首次发现。并建立了同时测定牛蒡叶中五种主要活性成分(绿原酸、苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、芦丁)的HPLC分析方法,色谱条件为:色谱柱Waters symmetry C18;流动相甲醇(A)+ 20mmol/L甲酸水溶液(B),梯度洗脱;流速1mL/min;柱温30℃;检测波长280nm。所建立的方法方便快速,检测限达0.005μg/mL,回收率为95.7-105.8%,精密度为1.58-2.86%。 3.牛蒡叶功能性成分的抗氧化、抗菌活性 牛蒡叶总提取物清除DPPH自由基的IC50值为0.9 mg/mL,抑制脂质过氧化的IC50值为0.8 mg/mL;在浓度为2.5 mg/mL时,该提取物的羟自由基清除活性为55.21%,超氧阴离子自由基清除活性为79.80%。在总提取物萃取分级组分中,乙酸乙酯组分(EF)具有最强的抗氧化活性,其清除DPPH自由基、抑制脂质过氧化的的IC50值分别为90.67与133.91μg/mL,EF的抗氧化活性与TBHQ相近,因此EF有望替代合成抗氧化剂。且EF与TBHQ表现为协同增效作用,这为组合抗氧化剂的使用提供了基础。 牛蒡叶总提取物对六种食品相关细菌(大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌)具有抑制活性,最低抑菌浓度(MIC)为1.5-2.5mg/mL;对三种真菌(黑曲霉、酿酒酵母、扩展青霉)的抑制效果不明显。探讨了牛蒡叶总提取物的萃取分级组分对6种食品相关菌的抑制情况。结果表明,乙酸乙酯组分(EF)能够抑制全部受试菌,EF的抗菌活性最强,其MIC为88-352μg/mL。杀菌试验表明,经过12h,在浓度为1×MIC,3×MIC和5×MIC时,EF能够杀灭4/6,6/6和6/6的受试菌。所以,EF是一种有效的天然杀菌剂资源。从牛蒡叶中纯化得到的对香豆酸的抗菌活性比绿原酸强,对香豆酸对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌的MIC分别为:20、10、20、20、20、80μg/mL。通过经口急性毒性初步试验测定得出EF的LD5010000mg/kg,属于实际无毒级。对于各个组分,抗氧化、抗菌活性与其多酚含量密切相关(R=0.86 ~0.99)。因此组分的抗菌、抗氧化活性主要是绿原酸、对香豆酸、芦丁、咖啡酸、水杨酸等多酚化合物共同作用的结果。 4.对香豆酸、绿原酸的抗菌机理 在多酚化合物绿原酸、对香豆酸作用下,都引起了痢疾志贺氏菌细胞膜通透性增大,导致了明显的胞内离子泄露及电导率的增大。流式细胞仪的分析表明,经过绿原酸或对香豆酸作用后,都导致了细菌细胞膜破裂。透射电镜实验结果直观的表明,对香豆酸、绿原酸都能导致细胞膜破裂或孔洞形成,导致细菌细胞内容物外泄,最终导致痢疾志贺氏菌死亡。 对香豆酸、绿原酸进入细菌细胞后,其作用靶标是DNA。琼脂糖凝胶电泳、荧光光谱分析表明,对香豆酸或绿原酸都不能断裂细菌基因组DNA,而是结合DNA。圆二色谱表明对香豆酸、绿原酸结合到DNA的链上以后,使其双螺旋结构变得松散,并造成了细菌DNA构象的改变。从而改变了细菌的各种生理功能,最终导致细菌死亡。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R284.1;R285

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【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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