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《江南大学》 2010年
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基于生化策略与组学技术的维生素C生产菌株间生理关系解析

张静  
【摘要】: 本文以能在胞外大量积累2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的工业生产菌株酮古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)组成的混菌体系为研究对象,在充分理解B. megaterium在维生素C混菌发酵体系中重要生理作用的基础上,借助两菌全基因组测序和蛋白质组学解析方法,就混菌发酵培养中B. megaterium如何促进K. vulgare生长和2-KLG高效合成的生理机制开展研究。主要研究结果如下: 1.采用可定向破坏细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间β-1,4糖苷键的溶菌酶以研究混菌发酵体系中调控B. megaterium生长状态对K. vulgare生长和2-KLG合成的影响。添加溶菌酶显著降低了B. megaterium的细胞存活率,但不影响K. vulgare细胞的正常生长。在B. megaterium对数末期(12 h)添加10,000 U/mL溶菌酶导致B. megaterium迅速裂解快速释放胞内活性物质,显著促进了K. vulgare生长。与对照组相比,K. vulgare最大细胞浓度和2-KLG生产强度分别提高了27.4%和28.2%,发酵周期缩短12 h; 2.利用Sanger shotgun法与454高通量基因组测序(GS FLX Titanium System)相结合的测序策略,对K. vulgare WSH-001进行全基因组测序。K. vulgare WSH-001基因组全长为3.28 Mb (染色体+质粒),包括一条长度为2,766,400 bp的染色体和长度分别为267,986 bp和242,715 bp的两个质粒。进化关系分析表明,K. vulgare WSH-001比其亲缘关系最相近的P. denitrificans PD1222和R. sphaeroides KD131均少了一个1 Mb以上的小染色体,推测K. vulgare单菌生长较弱的原因在于其与伴生菌B. megaterium长期共存过程中进行了基因组缩减,丢掉了其单独生长所必需的部分基因,导致其DNA复制系统、氨基酸代谢系统、能量代谢系统、辅因子代谢系统等大量相关基因在基因组中未找到。基因组信息显示,K. vulgare WSH-001基因组中含有从D-山梨醇到2-KLG转化所需要的全部蛋白所需的基因; 3.混菌培养过程中,K. vulgare细胞生长和2-KLG合成强烈依赖于B. megaterium。对B. megaterium WSH-002进行全基因组测序,得到由一条长度为4,047,912 bp的染色体和长度分别为74,613 bp、9,699 bp和7,006 bp的三个质粒组成的全长4.14 Mb基因组。对基因组进行注释发现,除了DNA修复系统中未发现编码DNA聚合酶III中θ、χ、ψ亚基的基因和Dam甲基化酶编码基因外,B. megaterium WSH-002的其他代谢途径基本完整;B. megaterium WSH-002与已经测序的B. megaterium QM B1551的亲缘关系最近,两者的16S rDNA序列的相似性为100%,核酸序列的相似性为95-97%。从进化树来看,B. megaterium WSH-002与B.cereus组群亲缘关系较近,有40%的保守基因; 4.为了阐明B. megaterium对K. vulgare的伴生机制,研究了产酸稳定期K. vulgare在B. megaterium伴生与否时胞内蛋白表达差异情况。对质谱鉴定得到的419种蛋白点进行COG注释发现:(1)约有20%蛋白点与氨基酸转运与代谢相关;(2)与蛋白质翻译、核糖体结构、生物合成、能量产生与转化相关的蛋白占总鉴定蛋白的10.5%和8.6%。当B. megaterium和K. vulgare共同培养时, K. vulgare胞内总蛋白点(已表达)比K. vulgare单独培养时增加了约30%。进一步进行差异表达谱分析发现,151种蛋白在B. megaterium伴生时表达量显著升高,其中氨基酸代谢、蛋白质翻译、能量代谢等相关蛋白约占41%。此外,B. megaterum还明显促进了K. vulgare的辅因子代谢、细胞壁和细胞膜合成等; 5.为了获得一种K. vulgare和B. megaterium生长和高效产酸的全合成培养基,以满足两菌基因组规模代谢网络构建与验证和定量模拟的需求。作者详尽分析了18批次玉米浆组分(约为40种,其中17种为氨基酸、9种为维生素和14种为金属元素)的含量,其中氨基酸约占30%,金属元素占10%左右,此外还含有8种水溶性维生素。玉米浆组分浓度变化高度线性关联2-KLG发酵参数的变化:丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、烟酸和生物素这6种组分对2-KLG生产效率产生显著影响。基于上述定量测定与定性分析,结合正交实验得到影响2-KLG生产效率的关键玉米浆组分的最佳组合为:丝氨酸0.28 g/L、甘氨酸0.36 g/L、苏氨酸0.18 g/L、脯氨酸0.56 g/L、烟酸0.19 g/L、生物素0.62 mg/L。采用这一最佳营养组合,经28 h培养,K. vulgare最大细胞浓度、2-KLG产量、生产强度和转化率分别达到4.14×109 cfu/mL、58 g/L、2.07 g/(L·h)和0.76 g/g。实现了K. vulgare和B. megaterium混菌体系在全合成培养基上的快速生长和2-KLG的高效生产。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ466.3

【参考文献】
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