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《江南大学》 2010年
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微孢根霉华根霉变种CICIM F0088生淀粉酶系的研究

李彧娜  
【摘要】: 本研究从各类样品中分离得到365株具有淀粉水解能力的丝状真菌并保藏于江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心,建立了一个丝状真菌资源库。从该资源库中筛选出一株具有较强生淀粉水解能力的混合淀粉酶系产生菌株CICIM F0088。结合形态学观察以及ITS序列同源性分析,确认该菌株为微孢根霉的华根霉变种(Rhizopus microsporus var. chinensis)。研究发现CICIM F0088菌株在固态和液态发酵时所产生的淀粉酶量和淀粉酶系的组成均存在差异。 本文首次对Rhizopus microsporus var. chinensis在固态和液态两种发酵方式下所产生的淀粉酶系进行系统的研究和比较。经过硫酸铵沉淀、双水相分离、离子交换层析、制备电泳和凝胶过滤层析等五种纯化方法,从CICIM F0088菌株的固态发酵产物中分离得到三个电泳纯的酶蛋白GA A,GA B和AA,酶蛋白的分子量依次为53、52和55 kDa;采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和制备电泳等三种纯化方法,从液态发酵产物中分离得到两个电泳纯的酶蛋白GA C和GA D,酶蛋白分子量分别为53和52 kDa。 对从CICIM F0088菌株分离纯化得到的5个淀粉酶的酶学性质进行了研究,发现固态发酵时产生的葡萄糖淀粉酶GA A和GA B的温度耐受范围、pH耐受范围以及生淀粉水解能力均优于液态发酵产生的GA C和GA D;上述四个葡萄糖淀粉酶都具有一定的生淀粉水解能力,而固态发酵时产生的α-淀粉酶AA不具有该能力。 结合Rhizopus属来源的葡萄糖淀粉酶氨基酸保守序列及Rhizopus microsporus密码子偏好性等信息设计简并引物,利用PCR技术扩增得到CICIM F0088菌株葡萄糖淀粉酶编码基因的部分DNA序列,再通过反向PCR获得已知序列的侧翼序列,最终获得完整的编码基因gluE。以此为基础,通过RT-PCR的方法扩增出了该基因完整的cDNA序列。通过比较gluE基因的DNA和cDNA序列发现,gluE基因全长2763 bp,内部存在四个内含子;该基因的cDNA全长1818 bp,其中信号肽编码区81 bp,成熟肽编码区共编码579个氨基酸残基。将成熟肽的氨基酸序列与GenBank中其他微生物来源的葡萄糖淀粉酶一级结构进行同源性比对分析发现,该酶与所有已知葡萄糖淀粉酶的最高同源性为80%,是一种新的葡萄糖淀粉酶。 将葡萄糖淀粉酶基因gluE的cDNA序列连入pET-28a(+)表达载体,构建了重组质粒pET-28a-gluE,在Escherichia coli BL21 (DE3)中成功实现了异源活性表达。利用His-tag亲和层析分离纯化了表达后的重组酶蛋白GA E,对重组酶的酶学性质进行了研究,发现其具有水解生淀粉的能力。
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