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《江南大学》 2010年
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酵母全细胞不对称还原法合成光学纯α-羟基酸及其脱氢酶特性的研究

郭金玲  
【摘要】: 生物催化以其高效的立体、位置和化学选择性成为合成光学纯手性化合物的重要手段。光学纯α-羟基酸类手性砌块是重要的精细化工中间体和手性药物前体。(R)-扁桃酸结构单元是其中最具有应用价值的代表,它不仅是半合成青霉素、头孢菌素、减肥药物和抗肿瘤药物等多种手性药物的重要砌块,还是应用广泛的手性拆分剂。微生物不对称还原途径以其理论产率高、操作简便成为合成此类化合物最直接和可行的方法。但目前仍存在催化剂稳定性差、全细胞传质阻力和终产物浓度低等问题。本论文以(R)-扁桃酸为模型产物,以克服生物催化反应中的主要限制因素、提高生物催化效率为目标,通过生物催化剂筛选、合理设计生物催化过程、对底物进行修饰和采取原位分离策略等方法使微生物不对称还原潜手性化合物合成(R)-扁桃酸类结构单元的效率明显提高。此外,对全细胞催化剂内起关键作用的醇脱氢酶进行了纯化和酶学性质研究,为其应用和进一步改造提供指导。主要结果如下: (1)以苯甲酰甲酸为模型α-酮酸底物,针对底物极性和酸性导致的生物催化剂稳定性差的问题,采取逐步提高底物浓度的连续分批选择方法获得了具有较好操作稳定性的全细胞催化剂葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus GIM 2.105)。该催化剂在连续分批转化20批后仍具有较高的催化活性,4℃储存5周对催化剂的活性影响很小。对此催化剂的底物特异性进行了研究,发现它对4种苯甲酰甲酸的苯环取代衍生物也具有很好的催化效果,产物(R)-扁桃酸衍生物的转化率和对映体过量值(ee值)分别保持在90%和95%以上。 (2)利用硫酸铵盐析、苯基疏水层析和凝胶过滤等纯化了S. ellipsoideus胞内D-扁桃酸脱氢酶,纯化倍数为46倍。该酶的亚基分子量为44 kDa,催化还原反应的最佳辅酶是NADPH,这些性质与其他来源的D-扁桃酸脱氢酶不同。S. ellipsoideus D-扁桃酸脱氢酶催化还原反应的最适pH和温度分别为pH 5.5和30℃,在pH 5.5– pH 8.0和温度低于30℃时保持相对稳定。 (3)研究了影响S. ellipsoideus全细胞不对称还原苯甲酰甲酸的主要因素,确定最适反应条件为:限氧条件下、pH 7.5、温度35℃、葡萄糖作为辅助底物、其最适浓度是10 g/L。在此条件下,当底物浓度为30 mmol/L时,转化48 h后,产物(R)-扁桃酸的转化率和ee值分别达到90%和99%以上。在监测S. ellipsoideus不对称还原苯甲酰甲酸的进程时发现转化初期12 h无产物生成,即存在转化初期停滞现象。通过研究关键醇脱氢酶活性、辅助底物和全细胞催化剂的传质阻力等影响因素,确定全细胞对底物/产物的传质阻力是导致此反应时间长的原因。通过改变底物结构,即将原α-酮酸底物变为α-酮酯底物,可以使不对称还原反应的时间明显降低。 (4)通过筛选更适合催化α-酮酯底物不对称还原的生物催化剂以及合理设计反应过程进一步提高了此类化合物的生物合成效率。以苯甲酰甲酸甲酯为模型α-酮酯底物,通过对反应特异性限制因素(如底物和产物的化学稳定性等)的研究,发现底物和产物的水解是此反应的主要限制因素。通过初步选择生物催化体系的pH值将底物和产物的水解损失降至最低。在此较适pH值下,对实验室保藏的37株酵母菌进行筛选,获得了对底物苯甲酰甲酸甲酯具有较高催化活性和立体选择性的全细胞催化剂酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae AS2.1392)。研究了其催化不对称还原α-酮酯的主要影响因素,确定最适转化条件为:pH 6.5、温度25℃、葡萄糖作为辅助底物、其最适浓度是20 g/L。在此条件下,当底物浓度为30 mmol/L时,反应在1.5 h之内结束,产物(R)-扁桃酸甲酯的产率和ee值分别达到92.4%和95%。 (5)研究了底物和产物浓度对S. cerevisiae全细胞不对称还原α-酮酯的影响,建立了底物和产物抑制模型。当底物浓度为43 mmol/L时反应初速度最大,随着底物浓度的升高或降低反应初速度降低;产物浓度的增加使反应初速度呈下降趋势,当产物浓度高于100 mmol/L时,反应初速度迅速下降。为了降低底物/产物对不对称还原反应的抑制效应,采取了树脂辅助原位分离的策略。通过测定不同类型吸附树脂对底物和产物的吸附容量和对不对称还原反应的影响,筛选出对此不对称还原反应具有较好促进作用的大孔吸附树脂NKA-Ⅱ;在适合的树脂加入量和加入模式下,产物(R)-扁桃酸甲酯的浓度可以达到128.2 mmol/L。
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