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《江南大学》 2010年
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桦褐孔菌多糖纯化、结构及其抗肿瘤机制研究

陈义勇  
【摘要】:桦褐孔菌(Inonotus obliquus (Fr.)Pilat)属于多孔菌科(polyporaceae)、褐卧孔菌属,主要分布在北纬45°-50°地区,如北美、芬兰、波兰、俄罗斯、中国的黑龙江和吉林(长白山)、日本等国家和地区。桦褐孔菌无明显毒副作用,具有抗癌、治疗糖尿病、预防艾滋病、抗衰老、增强免疫力等功能。桦褐孔菌多糖具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节、抗氧化等作用,目前国内外对桦褐孔菌及其多糖的研究相对还比较薄弱,对桦褐孔菌多糖分离纯化、结构、抗肿瘤作用机制的研究鲜有报道。本论文在桦褐孔菌粗多糖(IOP)提取、初步纯化的基础上,系统研究了IOP的理化性质、抗肿瘤活性,并对lOP进一步分离纯化,筛选抗肿瘤活性强的单一组分IOP3a,并对其结构特征、体内抗肿瘤活性机理以及诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制进行了研究,研究结果如下: 分析了桦褐孔菌原料组成:水分3.5士0.36%,粗蛋白2.4±0.44%,粗脂肪1.7±0.25%,灰分10.4±0.44%,粗纤维67.5±0.95%,还原糖4.2±0.30%,多糖10.3±0.40%。 通过正交实验确定了传统水浸提IOP的最佳工艺参数:提取温度90℃,时间4h,料液比1:30(W/V)。运用响应面分析方法,确定了超声-微波辅助提取IOP最佳工艺参数:微波功率90W,料液比1:20(W/V),提取时间19min。与传统水浸提法相比,超声-微波辅助提取时间短,多糖得率从2.12%增加到3.25%,纯度从64.03%增加到73.16%。通过红外光谱分析两种提取方法所得的多糖结构基本相同,超声-微波辅助提取法优于传统水浸提法。脱色和脱蛋白实验证实聚酰胺吸附柱层析法为IOP脱蛋白和脱色的理想方法。 研究了IOP的理化性质,并对其进行抗肿瘤活性评价。IOP干品呈现淡咖啡色,无味,易溶于水,但不溶于无水乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂。多糖、糖醛酸含量相对较高,不含蛋白质,单糖组成为Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal,摩尔比为10.25:9.38:1:12.45:9.9:11.55。采用HPLC凝胶色谱柱测定IOP的相对分子质量为156611Da。黏度性质研究表明lOP在一定的温度范围内随着温度的升高,黏度逐步增加,超过一定温度后,其黏度变化很小,pH对其黏度影响不大,金属离子影响显著,其中Ca2+、Mg2+影响较大,K+、Na+影响较小,低浓度尿素可使黏度增加,过高浓度可使黏度下降。体外抗肿瘤活性表明IOP在体外具有直接杀死Jurkat和Daudi肿瘤细胞的作用,最高抑制率分别为62.29%和66.42%,具有良好的剂量-效应关系,体内抗肿瘤活性表明IOP体内抗肿瘤活性显著,大小剂量对Jurkat荷瘤的抑制率分别为57.48%和43.52%,能显著提高裸鼠的脾脏指数,有效保护裸鼠免疫器官,对Jurkat肉瘤裸鼠单核巨噬细胞吞噬功能有明显的增强作用。 对lOP分级纯化并对组分进行抗肿瘤活性筛选,DEAE-SepharoseCL-6B柱分离纯化得到4个多糖组分:IOP1为中性多糖,IOP2、IOP3和IOP4为酸性多糖,多糖的回收率达85.6%。对四个组分进行体外抗肿瘤活性筛选,筛选出抗肿瘤活性较高的组分IOP1和IOP3。 IOP3和IOP1经过SepharoseCL-6B凝胶柱色谱洗脱分离,分别得到两个相对分子质量不同的组分IOP3a、IOP3b和IOPla、IOPlb,对其体外抗肿瘤活性进行筛选,实验结果表明,IOP3a和IOPlb活性较强,采用凝胶柱层析、HPLC和琼脂糖凝胶电泳法鉴定表明IOP3a和IOPlb为均一性组分。经HPLC测定IOP3a相对分子质量为44265Da,IOPlb相对分子质量为153172Da,通过气相色谱测定IOPlb单糖为葡萄糖,推测是一种p-葡聚糖。 通过建立裸鼠Jurkat模型,对IOP3a的体内抗肿瘤活性及其机制进行了研究,实验结果表明,IOP3a高、中剂量组瘤重与阴性对照组相比均有显著性差异(p0.05),肿瘤抑制率分别为69.28%和57.62%,具有明显的剂量-效应关系。随着剂量的增加,脾脏指数有逐步增加的趋势,具有升高裸鼠WBC和淋巴细胞的功能。组织病理学观察表明,IOP3a可使肿瘤组织中呈现明显的肿瘤坏死灶,瘤组织出现坏死的现象。通过免疫组化表明IOP3a体内抗肿瘤机制:通过促进肿瘤组织细胞中Bax蛋白表达、抑制Bcl-2表达起到抗肿瘤作用。 采用光学显微镜、扫描电镜、荧光显微镜、流式细胞术及蛋白质印迹等技术,探讨IOP3a诱导肿瘤细胞Jurkat和Daudi凋亡机制,实验结果表明,IOP3a作用后肿瘤细胞形态有明显差异,光镜下Jurkat和Daudi细胞分布不均匀,部分皱缩,形态不规则。荧光显微镜下细胞核呈致密浓染,呈现亮蓝色,呈现凋亡细胞特征。扫描电镜下细胞膜上大量微绒毛消失,最终脱落形成膜包被的凋亡小体。FITC-AnnexinV/PI双染色法检测结果表明IOP3a作用Jurkat和Daudi细胞48h后,细胞凋亡率分别为16.8%和23.1%。通过蛋白质印迹技术检测Cytc的释放和caspase-3酶的表达,借助于DNA ladders凝胶电泳分析,确定IOP3a诱导肿瘤细胞凋亡机制:通过刺激肿瘤细胞线粒体释放Cytc,活化caspase-3进而激活内源性核酸内切酶,引起DNA裂解实现其抗肿瘤作用。 通过甲基化分析方法,结合GC-MS.NMR和FT-IR等测试手段对IOP3a的结构进行分析,结果显示:IOP3a是由→4)-α-GapA(1→通过O-4位与→2)-α-Rhap(1→、→2,4)-α-Rhap(1→连接形成主链,主链中的→2,4)-α-Rhap(1→通过O-4与其它糖残基连接形成支链。→4)-β-Galp(1→、→6)-β-Glcp(1→、→5)-α-Araf(1→聚合形成半乳聚糖、葡萄聚糖和阿拉伯聚糖是IOP3a侧链的主要组成,其支链通过Gal残基、Glc残基和Ara残基的O-1位与主链的Rha残基的O-4相连。侧链→6)-β-Galp(1→构成的半乳聚糖通过O-4和O-6产生分支,侧链→5)-α-Araf(1→构成的阿拉伯聚糖通过O-3产生分支。 通过刚果红实验和紫外光谱手段对其构象进行研究,表明IOP3a是一有序的三股螺旋结构,温度对其构象没有太大的影响,酸、碱和金属离子能引起IOP3a三股螺旋构象发生了一定程度的改变,热重分析表明IOP3a在170-500℃之间发生分解,出现快速失重。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ461

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张慧丽;靳宝峰;李辉;刘宏生;;桦褐孔菌酸奶的工艺及药用功能的研究[J];饮料工业;2006年05期
2 张文超,蔡妙颜,李琳,李冰;物理波强化提取金针菇多糖[J];食用菌;2001年01期
3 禚同友;周丽洁;陈艳秋;;桦褐孔菌菌丝体水溶性多糖提取条件试验[J];食用菌;2007年04期
4 樊黎生;张声华;吴小刚;;微波辅助提取黑木耳多糖的研究[J];食品与发酵工业;2005年10期
5 许泓瑜;孙军恩;陆震鸣;许正宏;;桦褐孔菌菌粉多糖提取工艺的优化[J];食品与发酵工业;2008年11期
6 吴艳;艾连中;Steve W.Cui;顾小红;汤坚;;微波辅助提取胖大海多糖的工艺研究[J];食品工业;2007年01期
7 高雪丽;高愿军;吴广辉;;桦褐孔菌功能特性的研究进展[J];食品与机械;2006年05期
8 高愿军;王娟娟;司俊娜;张永峰;张家泉;;两种方法提取桦褐孔菌多糖工艺研究[J];食品与机械;2009年05期
9 高雪丽;高愿军;李建光;司俊娜;;桦褐孔菌多酚对食用油脂的抗氧化效应研究[J];食品工业科技;2008年01期
10 王志高;鄢贵龙;武华宜;易梦雅;;超声-微波协同萃取枇杷叶多糖的工艺研究[J];食品工业科技;2008年08期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 王黎明;具有降血糖活性的茶多糖组分分离纯化与结构鉴定[D];江南大学;2006年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马利华;秦卫东;陈学红;沈阳;;超声波—微波协同提取牛蒡多糖工艺的研究[J];徐州工程学院学报(自然科学版);2008年03期
2 马利华;;牛蒡中类胡萝卜素的提取工艺[J];徐州工程学院学报;2007年02期
3 张伟娟,廖隆理,谭国业,陈敏,但卫华,李志强;AS1.398和2709混合蛋白酶脱毛对猪皮蛋白的水解(续)[J];皮革科学与工程;2002年06期
4 孙丹红,韩劲,曹明蓉,石碧;超声波对裸皮脱脂的影响[J];皮革科学与工程;2003年03期
5 马建中;吕斌;薛宗明;;CMI系列酶制剂在浸水中的应用研究[J];皮革科学与工程;2006年06期
6 傅小燕;顾国贤;钟丽玉;;啤酒辅料大米企业标准的研究[J];啤酒科技;1999年04期
7 杜丹;赵春燕;;啤酒酵母残渣提取甘露聚糖的研究[J];啤酒科技;2006年06期
8 王启芳;;血浆(1-3)-β-D-葡聚糖检测对临床侵袭性真菌感染诊断价值的研究[J];临床合理用药杂志;2012年01期
9 李波;芦菲;魏新军;;二维核磁共振对羊栖菜褐藻糖胶DJL的结构研究[J];波谱学杂志;2006年04期
10 任风芝;陈书红;张雪霞;李丽红;高月麒;王宁;;胭脂树低聚糖的结构分析[J];波谱学杂志;2011年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭雨桐;;灵芝多糖的研究进展[A];园艺学文集5[C];2010年
2 衣美艳;范秀萍;吴红棉;胡雪琼;;马氏珠母贝各组织及其糖胺聚糖中四种重金属含量分析[A];广东省食品学会第六次会员大会暨学术研讨会论文集[C];2012年
3 张亚敏;刘捷;王文;;皱皮木瓜多糖的单糖组成分析[A];河南省化学会2010年学术年会论文摘要集[C];2010年
4 邓义;钟志京;何小波;辉永庆;刘秀华;;As、Hg的HG-AFS同时测定研究[A];四川省环境科学学会二〇一一年学术年会论文集[C];2011年
5 贾宁;;茯苓多糖的生物活性研究[A];科技创新与产业发展(A卷)——第七届沈阳科学学术年会暨浑南高新技术产业发展论坛文集[C];2010年
6 周亚军;康建波;刘妍菊;苏丹;马龙彪;;混合肉肌原纤维蛋白特性研究[A];管产学研助推食品安全重庆高峰论坛——2011年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨全国食品科学与工程博士生学术论坛论文集[C];2011年
7 代辉;刘振;夏池;王键吉;;纤维素经离子液体[Amim][COOH]预处理酶解糖化[A];2009全国可再生能源—生物质能利用技术研讨会论文集[C];2009年
8 高德;孙智慧;巩雪;;大米保鲜包装技术研究[A];2007年学术年会论文集[C];2007年
9 崔宏春;余继忠;周铁锋;黄海涛;张建勇;江和源;江用文;;茶多糖研究进展[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第二卷)[C];2010年
10 龚加顺;胡小静;彭春秀;周红杰;;普洱茶及其原料多糖分子组成及光谱学特性研究[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第二卷)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 李蓉;一种新型虫草生物学及其活性物质的研究[D];中国海洋大学;2009年
3 常耀光;海参岩藻聚糖硫酸酯及其酶解产物的制备、结构与活性研究[D];中国海洋大学;2010年
4 郭守东;微生物胞外多糖的结构及其抗氧化活性研究[D];中国海洋大学;2010年
5 李兆杰;壳聚糖快速制备技术及降血脂、免疫增强活性研究[D];中国海洋大学;2010年
6 张延妮;珠子参化学成分及其活性成分的筛选研究[D];陕西师范大学;2010年
7 王大红;粘细菌Stigmatella WXNXJ-B产生新型抗肿瘤抗生素的研究[D];江南大学;2010年
8 徐军;富苯丙氨酸碱性短肽的发现及其对蛋白质等电点和免疫交叉反应的影响[D];华南理工大学;2010年
9 孔凡利;荔枝果肉多糖的分离纯化与结构表征及抗氧化活性研究[D];华南理工大学;2010年
10 刘慧敏;清肝降压饮对自发性高血压大鼠心肌肥厚的干预作用及机制研究[D];山东中医药大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周艳华;可溶性鸡蛋壳膜蛋白与多肽的制备及其抗氧化活性的研究[D];华中农业大学;2010年
2 段雅庆;芦笋中黄酮和多糖的复合提取及其抗氧化活性研究[D];华中农业大学;2010年
3 刘兰杰;一株热带假丝酵母利用木糖生长及其产酒精特性的研究[D];华中农业大学;2010年
4 冷一非;嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育、培养及冻干发酵剂的研究[D];华中农业大学;2010年
5 申君;桃蚜的抗药性监测、杀虫剂的配方筛选及其增效生化机理的研究[D];华中农业大学;2010年
6 张德;不同苦瓜品种(系)多糖的提取工艺优化和构效差异分析[D];华中农业大学;2010年
7 姚长江;丝裂霉素C预防硬膜外瘢痕粘连的分子生物学机制研究[D];南京医科大学;2010年
8 杜学敏;蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分组分的性质[D];河北大学;2007年
9 刘辉;红曲霉发酵提高γ-氨基丁酸含量的研究[D];安徽工程大学;2010年
10 洪伟;酪蛋白中血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的研究[D];安徽工程大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 齐宝全;端粒、端粒酶及其在临床上的意义[J];皮肤病与性病;2003年03期
2 崔剑,李兆陇,洪啸吟;自由基生物抗氧化与疾病[J];清华大学学报(自然科学版);2000年06期
3 邵树军,刘彩玉,刘雄伯,王天元;牛膝多糖对小鼠免疫功能影响的研究[J];肿瘤防治杂志;2002年01期
4 王显艳,赵坤,温秋婷,张静艳,刘微;端粒、端粒酶与肿瘤的关系[J];齐齐哈尔医学院学报;2005年03期
5 许东晖,许实波,王兵,林永成,邵志宇;皱纹盘鲍多糖抗肿瘤药理作用研究[J];热带海洋学报;1999年04期
6 冯昆,张东杰,张涧铮,杨莹,王贺祥;凝固型金针菇酸奶的研制[J];饮料工业;2005年03期
7 张慧丽;靳宝峰;李辉;刘宏生;;桦褐孔菌酸奶的工艺及药用功能的研究[J];饮料工业;2006年05期
8 何春雷,杜晓;茶叶成份综合提取技术研究──Ⅰ影响茶多酚、咖啡碱、叶绿素抽提条件的初探[J];四川农业大学学报;1994年03期
9 靳胜英,李久长;银耳多糖提取工艺的研究[J];山西食品工业;1995年03期
10 张庆殷,侯桂华,范祖森,曹容华,孙汶生;原代人脐静脉内皮细胞分泌IL-1的研究[J];山东医科大学学报;1997年03期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 崔基成;崔永;;桦褐孔菌抗氧化作用的研究[A];首届药用真菌产业发展暨学术研讨会论文集[C];2005年
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