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《江南大学》 2010年
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产精氨酸脱亚胺酶变形假单胞菌的筛选鉴定及酶的定向改造

刘咏梅  
【摘要】:精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase, ADI, EC 3.5.3.6),属于一类称为“胍基修饰酶”总科,催化精氨酸产生瓜氨酸和氨。该酶广泛存在于多种微生物中,但哺乳类动物细胞中没有该种酶。因其具有的成为精氨酸缺陷型肿瘤如肝细胞瘤、黑色素瘤抗癌药物的巨大潜力而被研究。 肝细胞癌是现在世界上病发率最高的癌症之一,每年新增一百万病例。近年来,精氨酸脱亚胺酶(ADI)的抗癌活性在国际上受到关注。美国食品药品管理局(FDA),欧洲药品审评署(EMEA)分别于1999年及2005年通过ADI-PEG-20作为罕见病药物用于治疗黑素瘤,肝细胞癌,目前三期临床正在进行中。本研究室通过筛选鉴定ADI产生菌株,并对该酶进行定向改造以改良其在体内生理条件下的酶活和酶学性质,为开发具有自主知识产权的抗癌新药提供酶源。 通过建立一种ADI产生菌的筛选方法,得到一株产ADI的菌株SWP1。对该菌进行形态、生理生化特征鉴定和16S rRNA基因序列分析,鉴定该菌为变形假单胞菌。该菌现保藏于中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心,保存号CGMCC No.2039,并已申请专利(一株产精氨酸脱亚胺酶菌株及其应用,专利号:200710107822.X)。 构建ADI编码基因arc A的重组表达载体pET24a-ADI,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达。通过对诱导表达条件的优化,确定在OD600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),30℃诱导4 h时酶活最高,为2.04 U/mL发酵液。重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)经离子交换层析和凝胶过滤层析后,得到电泳纯的rADI。比酶活为20.85 U/mg (pH 6.0,37℃), Km为2.88 mmol/L, Vmax为31.68 (μmol/min/mg,最适反应pH6.0。经凝胶过滤分析,该酶分子量为92.6kDa, SDS-PAGE电泳显示ADI条带大小为46kDa,说明重组精氨酸脱亚胺酶为同源二聚体。 研究表明,来源于变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039的重组ADI的最适反应pH为6.0,在pH 7.4(人体内生理pH在7.4左右)时残余酶活降低至10%以下;其Km (2.88 mmol/L, pH6.0),高于人血清精氨酸浓度(100-120μM)20倍以上。因此,该精氨酸脱亚胺酶的高Km值及生理pH条件下酶活较低的性质成为该酶抗癌活性研究的限制性因素。定向进化技术是改造分子朝既定目标进化的有力手段。基于改良的二乙酰一肟硫胺脲(测定瓜氨酸)方法,建立了简便灵敏的96孔板高通量筛选模型,用于获得生理pH条件下具有高酶活和低Km值的精氨酸脱亚胺酶。通过一轮易错PCR,从650个突变株中筛选获得一株优良的突变株M314,其生理pH条件下比酶活(9.02U/mg)较出发菌株(0.44 U/mg)提高20倍以上,Km值下降至0.65 mmol/L (pH7.4),最适pH从6.0提高至6.5。M314携带的三个突变位点分别为A128T,H404R和I410L,通过蛋白质同源建模分析了各突变位点在蛋白质结构和活性中的作用。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ925

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨成丽;郑迎迎;柯前进;李大力;;人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J];化学与生物工程;2007年01期
2 李加友;曹瑜;钱绍松;刘毅;刘茜;焦庆才;;精氨酸脱亚胺酶发酵条件研究[J];化学反应工程与工艺;2006年01期
3 刘吉华,袁生,戴传超;二十碳五烯酸等多不饱和脂肪酸高产菌的筛选[J];菌物系统;2000年03期
4 曹瑜,李加友,焦庆才;酶法转化制备L-瓜氨酸[J];精细化工;2005年10期
5 李凯;李成付;李加友;刘茜;焦庆才;;反胶束萃取精氨酸脱亚胺酶[J];精细化工;2008年02期
6 李加友;曹瑜;刘毅;焦庆才;;D-精氨酸酶法制备工艺研究[J];金陵科技学院学报;2006年04期
7 黄小龙,孙焕良,谢达平,项伟,李建军;亚麻微生物脱胶菌种的筛选与鉴定[J];生物学杂志;2004年01期
8 辛玉华,东秀珠,吴明强;ITS序列同源性在苏云金芽孢杆菌分型中的应用研究[J];微生物学通报;2000年03期
9 梁思宇,陆兆新,邹晓葵,张晓东;高溶纤酶活性枯草芽孢杆菌的分离筛选与鉴定[J];微生物学通报;2001年05期
10 倪丽娜;一株高产黑色素细菌的分离及鉴定[J];微生物学通报;2004年01期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 茅立华;精氨酸脱亚氨基酶基因克隆及在大肠杆菌中表达[D];南京理工大学;2005年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李桂霞;马汇泉;刘婧;董瑾;;番茄灰霉病高效拮抗菌株鉴定及抗菌活性研究[J];山东农业科学;2007年02期
2 解永梅;张成玲;赵永强;张薇;张广民;;山东省大白菜黑腐病病原的鉴定及其生物学特性的研究[J];山东农业科学;2007年06期
3 姚良同;丁延芹;刘尧;陈一然;杜秉海;李俊;;玉米秸秆低温快速腐熟菌的筛选、鉴定及效果试验[J];山东农业科学;2008年03期
4 朱彭玲;陈强;丁延芹;姚良同;杜志兵;王晶;杜秉海;;新疆地区棉花根际拮抗菌的筛选与鉴定[J];山东农业科学;2008年06期
5 张广志;周红姿;杨合同;赵晓燕;;盐碱土壤中耐盐细菌的分离与鉴定[J];山东农业科学;2008年09期
6 陈建爱;王未名;;木霉T1010固相培养产孢分析[J];山东农业科学;2008年09期
7 张一;王凤忠;张铭铄;李妍;韩明渠;周波;毛志泉;;苹果园土壤中一株根皮苷降解菌的筛选[J];山东农业科学;2011年12期
8 凌晨;刘波;;2,4,6-三溴苯酚降解菌的筛选[J];安徽化工;2012年03期
9 薛正莲;玉米生粉酒精发酵的研究[J];安徽机电学院学报;1996年02期
10 鲍立宁,洪桂云,黄显怀;电极生物膜脱氮工艺中反硝化菌相分析[J];安徽建筑工业学院学报(自然科学版);2004年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 窦瑞木;雷清泉;张改强;;番茄内生细菌TB-2生化特性及对番茄灰霉病菌的抑制作用[A];经济策论(上)[C];2011年
2 刘春;;鳢舒伯特气单胞菌内脏类结节病的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 马镝;;产壳聚糖酶菌株的筛选、鉴定及抑菌活性研究[A];科学发展与社会责任(A卷)——第五届沈阳科学学术年会文集[C];2008年
4 黄华伟;王印庚;陈霞;张凤萍;;渡夏期养殖刺参腐皮综合征的发生与环境因子间的关系[A];农产品质量安全与现代农业发展专家论坛论文集[C];2011年
5 邬纯鸿;黄毅;王文莉;钟代彬;吴广安;方艳军;;现代化奶牛场乳房炎病因调查及其防治[A];中国奶业协会年会论文集2009(上册)[C];2009年
6 余东游;刘韶娜;李卫芬;黄海智;;一株异养型亚硝酸盐转化菌的分离鉴定及特性研究[A];全国畜禽和水产养殖污染监测与控制治理技术交流研讨会论文集[C];2008年
7 胡治刚;胡江春;刘丽;汪思龙;苏振飞;王书锦;;海洋微生物复合制剂改善桉树人工林土壤质量研究[A];微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C];2008年
8 刘爱民;王敏;黄为一;;抗生素对一株假单胞菌耐镉能力的影响及其红外光谱分析[A];微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C];2008年
9 杨云娟;钟巧芳;唐湘华;李俊俊;黄遵锡;;一株异淀粉酶产生菌的粗酶酶学性质研究及发酵条件优化[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
10 刘彩琴;何国庆;陈启和;王伟;杨潞芳;阮晖;李青青;;一株产α-半乳糖苷酶菌的分离与选育[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
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1 郎亚军;Ectoines高效制备技术及其应用研究[D];大连海事大学;2010年
2 李永芹;养殖鱼类病原菌检测芯片技术的建立[D];中国海洋大学;2010年
3 赵祺;冻土细菌新种和冰缘植物内生细菌新种的特征和多相分类学研究[D];兰州大学;2010年
4 朱兵峰;枯草杆菌两步法生产四甲基吡嗪的调控及机制的研究[D];江南大学;2010年
5 王大红;粘细菌Stigmatella WXNXJ-B产生新型抗肿瘤抗生素的研究[D];江南大学;2010年
6 肖仔君;Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化潜手性酮不对称还原反应的研究[D];华南理工大学;2010年
7 苑博华;伯克霍尔德菌的筛选、鉴定及其发酵产低温脂肪酶的研究[D];江南大学;2010年
8 刘君昂;油茶林健康经营关键技术研究[D];中南林业科技大学;2010年
9 黎满香;感染猪的粪肠球菌的分离鉴定及部分特性和诊断方法研究[D];湖南农业大学;2010年
10 谢学辉;德兴铜矿污染土壤重金属形态分布特征及微生物分子生态多样性研究[D];东华大学;2010年
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1 陈若雯;高产胞外多糖乳酸乳杆菌的选育及其发酵条件的优化[D];华中农业大学;2010年
2 罗晶晶;斑点叉尾鮰生鱼片加工过程中的微生物变化[D];华中农业大学;2010年
3 郎晓磊;肠道菌对苏云金芽胞杆菌家蚕杀虫活性的作用[D];华中农业大学;2010年
4 逯晋忠;苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究[D];华中农业大学;2010年
5 张献芳;利用半夏凝集素构建内生工程菌及其抗同翅目害虫效果研究[D];华中农业大学;2010年
6 韩亚超;新型微生态制剂的研制[D];华中农业大学;2009年
7 袁玮;贵州省苗族腌酸汤中产乳酸菌素菌的筛选与初步研究[D];华中农业大学;2010年
8 贺中华;黄鳝肠道菌群的初步分析和益生菌的开发与应用研究[D];华中农业大学;2010年
9 孟小亮;黄颡鱼肠道益生菌的筛选及其应用研究[D];华中农业大学;2010年
10 田甜;鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及耐药性研究[D];华中农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘云,徐琪寿;氨基酸发酵生产的研究进展[J];氨基酸和生物资源;1999年04期
2 蒋昌顺,邹冬梅,SegenetKelemu;几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶对柱花草胶孢炭疽病原菌的抑菌效果[J];草地学报;2000年02期
3 蒋峰,倪晓冬,尹震宇,李幼生,刘放南,张丽华,李宁,黎介寿;在猪肝-肠联合移植中瓜氨酸是移植肠急性排斥反应的血清学指标[J];肠外与肠内营养;2004年04期
4 王立群,关凤芝,张福修,赵德宝,徐丽珍,宋宪友,果瑞平,宣世纬;亚麻微生物脱胶技术的研究──1脱胶菌株的筛选[J];东北农业大学学报;1994年02期
5 柳畅先;王永美;孙小梅;;反胶束萃取醇脱氢酶的研究[J];分析科学学报;2006年02期
6 李加友,曹瑜,焦庆才;酶法转化液中L-瓜氨酸的分光光度法测定[J];分析试验室;2005年12期
7 王岩,刘学惠,陆懋荪,尹佩玉,容蓉;几种天然黑色素分子结构的红外光谱表征研究[J];分析试验室;1996年06期
8 娄文勇,宗敏华,刘森林,李慧青;反胶束萃取酶蛋白的研究进展[J];工业微生物;2001年04期
9 蔡诗贵,熊家林;我国氨基酸生产现状和发展建议[J];湖北化工;2000年06期
10 李大力;郑迎迎;;人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其酵母表达[J];化学与生物工程;2006年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李凯;李成付;李加友;刘茜;焦庆才;;反胶束萃取精氨酸脱亚胺酶[J];精细化工;2008年02期
2 李加友;;高产精氨酸脱亚胺酶菌株筛选鉴定和发酵特性研究[J];食品科技;2010年05期
3 张媛媛;刘晓蓉;周爱芳;;恶臭假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶发酵条件及特性的研究[J];中国酿造;2011年07期
4 刘均忠;蒋丽丽;沈俞;刘茜;焦庆才;;固定化细胞酶法拆分DL-精氨酸[J];精细化工;2008年01期
5 李凯;李成付;李加友;刘茜;焦庆才;;双水相体系萃取精氨酸脱亚胺酶[J];精细化工;2008年09期
6 刘莉;刘毅;尹翠;缑灵山;朱炎;;与环境友好的化学-生物法制备D-精氨酸和L-瓜氨酸[J];当代化工;2008年05期
7 曹瑜,李加友,焦庆才;酶法转化制备L-瓜氨酸[J];精细化工;2005年10期
8 孟繁君;刘咏梅;孙志浩;倪晔;郑璞;;假单胞菌发酵制备精氨酸脱亚胺酶[J];中国医药工业杂志;2008年07期
9 刘毅;尹翠;缑灵山;朱炎;孙强;;化学-生物法制备D-精氨酸和L-瓜氨酸[J];化学研究;2008年04期
10 ;[J];;年期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘咏梅;产精氨酸脱亚胺酶变形假单胞菌的筛选鉴定及酶的定向改造[D];江南大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 蒋微琴;新一代聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶基础研究[D];浙江大学;2008年
2 黄亮;重组精氨酸脱亚胺酶的表达、纯化、复性及其生物活性研究[D];兰州大学;2008年
3 孟繁君;假单胞菌精氨酸脱亚胺酶的发酵制备与活性研究[D];江南大学;2008年
4 李振伟;重组精氨酸脱亚胺酶的异源表达、纯化及性质研究[D];江南大学;2008年
5 姜占坤;精氨酰胺类化合物与PAD4蛋白的对接分析及分子动力学模拟[D];天津大学;2008年
6 李娜;精氨酸脱亚胺酶的分泌型表达研究[D];江南大学;2010年
7 李利锋;利用定点突变法对微生物精氨酸脱亚胺酶进行定向改造研究[D];江南大学;2012年
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