收藏本站
《江南大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

利用不同底物生产1,3-丙二醇及基因工程菌的构建

马正  
【摘要】:1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,广泛应用于食品、医药等多个领域,其中1,3-丙二醇最重要的用途是作为合成新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的单体。但目前只有化学法实现了1,3-丙二醇工业化生产。与化学法相比,微生物法具有反应条件温和、对环境条件友好等优点受到广泛重视。迄今为止,自然界中的微生物只能以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇,由于原料成本较高,与化学法相比,微生物法制备1,3-丙二醇仍不具有竞争优势。为此,论文围绕“提高生产效率,降低生产成本”的研究目标,分别以Klebsiella pneumoniae,模式菌株Saccharomyces cerevisiae W303-1A和工业化甘油生产菌株Candida glycerinogenes为研究对象,采用基因工程、代谢工程和发酵工程等生物技术手段开展了应用微生物法生产1,3-丙二醇的研究,取得了以下主要研究成果: 1)为降低K. pneumoniae产1,3-丙二醇过程中由中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)累积对菌体生长和发酵的不利影响,以氯霉素乙酰转移酶基因cat为报告基因,成功构建了K. pneumoniae新型表达系统pETPkan,并应用该表达系统在K. pneumoniae中过量表达了1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT,构建了重组菌K. pneumoniae/pETPkan-dhaT。在发酵过程中,重组菌3-HPA的最大积累量与原始菌株相比,降低了约3倍,从而有效的促进了菌体生长、甘油消耗和产物合成,最终1,3-丙二醇产量为28.9 g/L,比野生菌提高了16.5%。 2)考察了摇瓶水平上初始甘油、氮源、无机盐等培养条件和pH、温度、接种量等发酵工艺条件对重组菌K. pneumoniae/pETPkan-dhaT甘油转化率和菌体生长的影响,通过单因素和正交实验设计,优化了发酵培养基组成:甘油60 g/L,酵母膏7g/L,(NH4)2SO40.3 g/L,柠檬酸8 g/L;优化了发酵工艺条件:初始pH 7.0,培养温度30℃,装液量50 mL/250 mL三角瓶,发酵接种量(v/v)6%。在优化的培养和工艺条件下,重组菌的1,3-丙二醇产量达到37.7 g/L,甘油质量转化率提高至62.8%。考察了7 L发酵罐上搅拌速度对1,3-丙二醇分批发酵实验的影响,在300 r/min的条件下,1,3-丙二醇浓度、甘油转化率分别最高达36.4 g/L,60%。7 L发酵罐补料分批发酵实验,发酵45 h后测得1,3-丙二醇产量为62.2 g/L 3)利用C. glycerinogenes生产的不同类型的甘油替代重组菌发酵培养基中的纯甘油。首先以C. glycerinogenes甘油发酵液直接作为原料,发酵结果显示,甘油发酵液中乙醇、乙酸等物质影响了菌体的生长和甘油的消耗,发酵50 h 1,3-丙二醇产量仅为8.9g/L;在添加NaCl维持高渗条件下,C. glycerinogenes发酵培养基初始葡萄糖浓度的降低有效减少了乙醇、乙酸的生成,以此发酵液作为重组菌K. pneumoniae/pETPkan-dhaT发酵底物,发酵40 h后,1,3-丙二醇产量为24.7 g/L;最后选择工业级甘油为底物发酵产1,3-丙二醇,测得1,3-丙二醇含量为33.5 g/L,甘油质量转化率为55.8%。以工业级甘油为原料, K. pneumoniae/pETPkan-dhaT 7 L发酵罐补料分批发酵,1,3-丙二醇产量达57.8g/L。以上实验结果说明工业级甘油可成为替代纯甘油发酵的廉价原料。 4)首先克隆了K. pneumoniae甘油合成1,3-丙二醇途径中8.0 kb左右大小的dha操纵子,并在大肠杆菌JM109中进行了有效表达,测得甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)比酶活分别为1.8 U/mg和0.8 U/mg,携带dha操纵子的大肠杆菌在以甘油为底物发酵时,可合成8.6 g/L 1,3-丙二醇;直接将8.0 kb dha操纵子在模式菌株酿酒酵母S. cerevisiae W303-1A中表达,由于GDHt和PDOR比酶活仅有0.4 U/mg和0.3 U/mg,最终导致在以葡萄糖为底物的发酵液中未检测到1,3-丙二醇;为增强dha基因在S. cerevisiae W303-1A中的表达,将dhaB和dhaT基因分别置于启动子GAP和转录终止子AOX1TT之间,利用游离型表达载体pYX212-zeocin在酿酒酵母中串联表达,测得重组酿酒酵母W303-BT的GDHt和PDOR比酶活分别为15.1 U/mg和12.3 U/mg;W303-BT直接以葡萄糖为底物发酵,最终测得1,3-丙二醇产量为1.2 g/L 5)将dha操纵子上的基因片段dha1 (dhaT+gdrB)和dha2 (dhaB+gdrA)分别置于启动子pGAP和AOX1TT之间,构建表达元件pGAP-dha1-AOX1TT和pGAP-dha2-AOX1TT并串联在根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin的T-DNA区域内,构建了重组质粒pGAP4。将质粒pGAP4电击导入根癌农杆菌LBA4404中,利用根癌农杆菌介导转化法(ATMT)转化C. glycerinogenes,经表型及PCR、Southern Blot验证后将遗传稳定的重组产甘油假丝酵母WL2002-GAP进行酶活检测,测得GDHt和PDOR比酶活分别为1.9 U/mmg和1.4 U/mg,以葡萄糖为底物发酵,最终测得1,3-丙二醇含量为2.9 g/L。 6)将质粒pGAP4中的启动子pGAP替换为来源于C. glycerinogenes的盐压诱导型启动子Pcggpd1,构建了质粒pGPD4。进一步通过ATMT获得了遗传稳定的重组产甘油假丝酵母WL2002-GPD,测得其GDHt和PDOR比酶活分别为5.1 U/mg和3.7 U/mg,较WL2002-GAP分别提高约2.7倍和2.6倍;以葡萄糖为底物发酵测得1,3-丙二醇为6.7g/L,较WL2002-GAP提高约2.3倍。 7)应用重组产甘油假丝酵母WL2002-GPD分别在发酵培养基添加0.5 mol/L和1mol/L NaCl的条件下发酵。结果表明,与未添加NaCl的发酵相比,随着发酵培养基中NaCl浓度的增加,重组产甘油假丝酵母WL2002-GPD GDHt和PDOR比酶活、1,3-丙二醇产量均有不同幅度的提高。
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张灿,张惠斌,黄海燕,黄文龙;非氨酯中间体2-苯基-1,3-丙二醇的合成[J];中国医药工业杂志;1996年10期
2 梁丽芸,蓝仁华,陈焕钦;Texanol和丙二醇对乳胶漆性能影响的研究[J];涂料工业;2003年08期
3 舒学军;桑晓燕;张界平;陈荷花;雷志伟;;香料苹果酯—B的合成研究[J];江西化工;2006年04期
4 李汉堂;;轮胎用自封式密封剂及其制造方法[J];世界橡胶工业;2007年03期
5 ;ISP原料及配方[J];中国洗涤用品工业;2007年03期
6 尤新;;生物质替代石化产品的发展动向(一)[J];精细与专用化学品;2008年05期
7 李子东;;维尔斯公司DMC联合装置运行正常[J];粘接;2009年06期
8 高志文;王寿峰;夏春谷;;磁性纳米粒子催化尿素与1,2-丙二醇制备碳酸丙烯酯[J];分子催化;2009年04期
9 谢鹏;梁淑娃;黄宜辉;;快速测定生产中纳他霉素含量的方法探讨[J];中国食品添加剂;2010年03期
10 常炳南 ,林富钦;钼(Ⅵ)螯合物催化辛烯-1环氧化[J];湘潭大学自然科学学报;1983年02期
11 Alan R.Katritzky;范伟强;李巧玲;;从2-(2-吡啶)-1,3-丙二醇衍生出的一些新的吡啶化合物(英文)[J];有机化学;1988年01期
12 胥治杰;刘江;;杀菌剂溴硝丙醇的合成[J];应用化工;1993年04期
13 钱霞;油脂直接氢化制脂肪醇和1,2-丙二醇技术[J];日用化学工业;1997年04期
14 ;当前热点化工产品技术现状与发展趋势(续)[J];中国石油和化工;2002年12期
15 ;Davy和Samsung合作开发丙二醇工艺[J];工业催化;2003年09期
16 谢家明;郭世卓;徐泽辉;;丙烯醛制备1,3-丙二醇的中型试验研究[J];石油炼制与化工;2006年05期
17 李凭力;曹明利;张学岗;解利昕;侯文贵;王世昌;;真空膜蒸馏用于多元醇水溶液分离的研究[J];水处理技术;2008年01期
18 李雅丽;;Shell开发CO_2为原料环境友好低成本丙二醇/聚碳酸酯生产工艺[J];化学反应工程与工艺;2009年06期
19 张凯蛟;林菁;张春辉;水琳;;丙二醇作发动机冷却液基液的探讨[J];石油商技;2002年03期
20 任宇,白庆中,覃汉生;用丙二醇碳酸酯对膨润土进行活化的研究[J];环境污染治理技术与设备;2005年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 展江宏;徐新良;魏伟;赵宁;;尿素和丙二醇合成碳酸丙烯酯新技术中试研究[A];第十三届全国催化学术会议论文集[C];2006年
2 陈钟德;;老年糠尿病71例临床分析[A];老年学论文集——福建省首次老龄问题学术研讨会论文选[C];1995年
3 马兰;贺德华;;Ru催化剂上丙三醇氢解制丙二醇的研究[A];第六届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2009年
4 韦旭钦;陈发忠;韦宇拓;齐向辉;黄日波;;甘油脱水酶的定向进化及其高通量筛选方法[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
5 马兰;贺德华;;丙三醇氢解制丙二醇Ru基催化剂的研究[A];中国化学会第27届学术年会第11分会场摘要集[C];2010年
6 任嘉;;啤酒的生产过程与制冷工艺[A];山东省第五届制冷空调学术年会论文集[C];2004年
7 梁雪云;王燕蓉;;低浓度的乙二醇、丙二醇及二甲基亚砜玻璃化液对人脐血造血干细胞冻存效果的研究[A];2007年中国解剖学会第十届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年
8 黄志华;黄星;张延平;曹竹安;;甲酸脱氢酶在1,3-丙二醇生产体系中的表达和应用[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年
9 吴哲;王凤寰;田平芳;谭天伟;;2,3-丁二醇氧化还原酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1,3-丙二醇的影响[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
10 李菲;董敏;王红武;公衍道;张秀芳;赵南明;;丙二醇和氮酮对角质层脂的不同作用模式[A];第七届全国生物膜学术讨论会论文摘要汇编[C];1999年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 玲玲;非石化原料合成1,2—丙二醇路线问世[N];医药经济报;2009年
2 记者 冯威力;致命假药所用丙二醇非出自泰兴厂[N];中国化工报;2006年
3 金咸 郭宁剑;市民应立即停用并举报问题药[N];温州日报;2006年
4 ;假冒“丙二醇”来源初步查清[N];新华日报;2006年
5 总后军需装备研究所 肖红;1,3丙二醇合成方法的探讨[N];中国纺织报;2009年
6 汪波 官颖;假药案原因初步查明[N];人民日报;2006年
7 李瑞 陈铁;发酵法1,3-丙二醇完成工业试验[N];中国化工报;2006年
8 记者 王眉灵;我市暂停使用问题辅料丙二醇[N];成都日报;2006年
9 饶兴鹤;今年全球PO/PG产需两旺[N];中国化工报;2005年
10 王乐民;齐二药“翻船”不偶然[N];健康报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马正;利用不同底物生产1,3-丙二醇及基因工程菌的构建[D];江南大学;2010年
2 薛学东;Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇的过程研究[D];华东理工大学;2011年
3 李志刚;发酵液中1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的双水相萃取研究[D];大连理工大学;2011年
4 董晓宇;大气压冷等离子体对Klebsiella pneumoniae灭菌机制和诱变研究[D];大连理工大学;2010年
5 刘重阳;非线性切换动力系统的最优控制及应用[D];大连理工大学;2010年
6 杜翠红;沼泽红假单胞菌RubisCO基因的克隆与表达及其固定二氧化碳特性的研究[D];大连理工大学;2003年
7 刘芳;分解肌酐、尿酸基因工程菌的构建及其功能研究[D];中南大学;2012年
8 王诗云;一类微生物发酵系统的双测度与全局稳定性[D];大连理工大学;2011年
9 郑静;甘油氢解反应中铜基催化剂的研究[D];吉林大学;2009年
10 罗晖;基因工程菌的构建及制备7-氨基头孢烷酸的研究[D];清华大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李玲;1,2-丙二出醇的催化精制过程[D];天津大学;2004年
2 杨绪壮;环氧丙烷反应精馏方法水合生成丙二醇过程模拟[D];北京化工大学;2000年
3 张晓松;硼酸丙二醇聚酯的合成及应用[D];广州大学;2010年
4 桂妍雯;产1,3-丙二醇克雷伯氏菌代谢调控的研究[D];山东轻工业学院;2012年
5 徐兴军;萃取分离提取发酵液中1,3-丙二醇[D];华东理工大学;2013年
6 韩守刚;1,2-丙二醇合成丙酮醛的催化剂研究[D];浙江大学;2006年
7 唐浩;利用克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)发酵产1,3-丙二醇研究[D];华东理工大学;2011年
8 黄永红;生物柴油副产甘油选择性脱水制备丙二醇[D];天津大学;2010年
9 陈金良;微生物发酵甘油产1,3-丙二醇的研究[D];河南工业大学;2010年
10 魏搏超;甘油生物转化联产乳酸及其盐析萃取[D];大连理工大学;2012年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978