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乳清蛋白酶解物对过氧化氢诱导的氧化损伤的保护作用

凌玉芳  
【摘要】:天然抗氧化肽因其天然性与安全性而在抗氧化领域备受瞩目,因此开发及应用蛋白源抗氧化肽具有十分广阔的前景。乳清蛋白作为优质的蛋白资源,已被众多研究者关注,并从中开发出生物活性肽。研究发现,乳清蛋白中可提取出具有抗氧化活性的生物肽,然而至今为止多数研究主要还是集中于乳清蛋白酶解工艺的优化和初步纯化过程。本研究旨在揭示乳源性抗氧化肽对氧化损伤的体内细胞的生物学效应,完善抗氧化肽的应激作用机制,引导抗氧化肽的应用方向,同时也对功能性物质的作用机制研究提供方法学借鉴,具有理论指导意义和拓展性科学意义。 论文首先通过双酶(胃蛋白酶-胰蛋白酶)水解乳清蛋白,得到粗酶制备物后经DA201-C型号大孔吸附树脂吸附洗脱,脱去大量的盐,产物(WPHs)的相对分子量主要分布在369~1980 Da,1000 Da以下片段的峰面积占总面积的61.51%;对WPHs的氨基酸组成分析显示WPHs富含必需氨基酸(43.72%)和疏水性氨基酸(40.75%);另外,WPHs具有良好的体外抗氧化活性,清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基的IC50分别为10.56 mg/mL、5.76 mg/mL,浓度为10 mg/mL时还原能力A700nm为0.577。PC12细胞接种至培养板中培养过夜,经不同浓度WPHs预孵2 h后,WPHs与100μmol/L H_2O_2共同处理24 h。细胞存活率(MTT法)结果显示100~400μg/mL浓度的WPHs可使H_2O_2诱导损伤的PC12细胞存活率提高20%~30%;WPHs对细胞本身具有促进生长的作用,浓度100~400μg/mL WPHs单独作用24 h,促生长效果显著,提高PC12细胞存活率1%~19%;100~200μg/mL WPHs对过氧化氢损伤PC12细胞的形态有改善作用,能明显减少皱缩及悬浮细胞数目。论文研究了WPHs抑制过氧化氢诱导氧化损伤的机理。采用酶试剂盒检测细胞内抗氧化酶系的活性,发现WPHs对PC12细胞总抗氧化能力及抗氧化酶系统有提高效果;细胞凋亡的检测使用核染色法,结果显示100~200μg/mL WPHs可抑制H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡,分别使细胞凋亡率下降8.3%~19%;应用流式细胞术研究细胞内Ca~(2+)浓度情况及线粒体跨膜电位,发现200μg/mL WPHs能够稳定胞内Ca~(2+)的浓度,并阻止细胞线粒体膜电位发生变化;用Caspase-3酶活试剂盒检测PC12细胞Caspase-3酶的活性,发现WPHs可以降低过氧化氢诱导引起的Caspase-3酶活性的提高程度;与凋亡蛋白表达水平的检测采用Western blot法,结果显示WPHs能够提高PC12细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,抑制Bax蛋白的表达及降低PARP的降解程度。 本文研究结果表明,WPHs含多量小肽,对细胞过氧化氢氧化损伤具有良好的保护作用,主要通过维持细胞信号通路的正常运行的方式,抑制细胞由过氧化损伤引起的凋亡。该酶解物耐消化、具抗氧化功效,适宜作为保健食品或食品添加剂。


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