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《江南大学》 2011年
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乳清蛋白抗氧化肽构效关系的研究

吴慧  
【摘要】:在食品中添加抗氧化剂是保证食品安全的重要方法,由于合成抗氧化剂的毒性受到质疑,人们越来越开始关注天然抗氧化肽。近来发现,乳清蛋白中存在具有抗氧化活性的序列,然而研究多集中于多肽的制备和初步的纯化,抗氧化肽的结构和功能关系尚不明确。本论文通过对乳清蛋白酶解、纯化、测序得到具有不同抗氧化活性短肽,采用量子化学计算来探讨抗氧化活性肽的结构和生物活性的关系,扩大干酪副产物应用范围,为肽类抗氧化剂的研究和应用提供理论参考。 本论文首先研究了乳清蛋白的酶解工艺,以水解度和DPPH自由基清除率为指标,从6种商品蛋白酶中确定了酶解最适水解酶为Alcalase 2.4L碱性蛋白酶,适宜的酶解条件为:底物浓度为45 mg/mL,[E]/[S]=2%(w/w),温度65℃,pH8.5,水解时间2 h。采用DA201-C大孔吸附树脂对乳清蛋白酶解物进行初步纯化,60%乙醇洗脱,吸附率,吸附量、解吸率和回收率分别为70.80%、28.15 mg/g、93.21%和65.74%。大孔吸附树脂处理后WPH清除DPPH·、O2-·的IC50由4.21 mg/mL、8.18 mg/mL降低到3.92 mg/mL、5.00 mg/mL,WPH的抑制脂质氧化的抑制率由41.98%升高到56.49%。酶解物中疏水性氨基酸含量从纯化前29.04 g/100g增加至纯化后35.34 g/100g。采用凝胶过滤色谱Sephadex G-15、制备型RP-HPLC和分析型RP-HPLC分离纯化大孔纯化产物,最后得到八个抗氧化活性不同的肽段D3a,D4a,D4b,D5a,D5b,D6b,D7a和D9a。经Q-TOF MS结构解析,其氨基酸序列分别为D3a(Arg-Val-Tyr) , D4a (Ala-His-Leu-Trp), D4b(Gly-Thr-Ser-Val), D5a(Val-Phe), D5b(Try-Ser-Leu), D6b (Leu-Phe) , D7a(Val-Ala-Gly-Thr-Ser-Val-Tyr), D9a(Trp-Tyr-Ser-Leu)。其中D9a (Trp-Tyr-Ser-Leu)的抗氧化活性最高,O2-·的清除率为87.90%(500μmol/L)。 采用量子化学方法对VF,LF,RVY,YSL,WYSL和GSTV六条肽段化学结构进行了分子模拟,优化分子结构得到优势构象,计算分子前线轨道能量,原子净电荷分布。结果表明前线轨道能级差与短肽的抗氧化活性相关,可以采用前线轨道能级差来表征短肽分子的生物活性大小;从原子净电荷分布推测确定了WYSL分子中自由基反应的活性位点为吲哚环上的N9-H49,吲哚环上各原子之间的二面角计算结果表明其二面角非常小,电荷流动性强,利于脱氢反应的进行。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TS201.2

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【引证文献】
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【同被引文献】
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