具有抗氧化活性的磷脂运载体制备、鉴定和功能研究

【摘要】：维生素C(Vc)是研究及应用最多的非酶类自由基清除剂,但高血糖可抑制其进入细胞,大剂量摄入Vc也抑制其转运蛋白表达。开发不依赖转运体的Vc载体可提高Vc的生物利用度。过氧化氢酶(CAT)是典型的酶类自由基清除剂,其最大的缺点是难吸收,容易被胃肠道及细胞溶酶体的蛋白酶降解。大豆磷脂酰胆碱基固体脂质纳米粒(PC-SLN)是新型绿色蛋白包封技术,可提高蛋白吸收率,防止酶解,在CAT保护方面具有应用价值。高纯度PC是制备磷脂复合物和固体脂质纳米粒的重要原料,本研究旨在建立基于大孔离子交换树脂的PC分离技术,并建立Vc-PC复合物和载CAT的PC-SLN的制备方法,研究其理化性质,评价其应用效果。 论文首先建立了大豆PC的HPLC-UV检测方法。分析条件如下:色谱柱为lichrospher Si (25cm×4.6mm,5μm);流动相为A-正己烷/异丙醇(V/V)=1:1,B-正己烷/异丙醇/1%冰醋酸水溶液(V/V/V)=4:4:1;流速:1.0mL/min;柱温:35℃;检测波长:205 nm。此条件下,磷脂中PC和磷脂酰乙醇胺(PE)在25 min内得到了很好的分离。 研究了用大孔型离子交换树脂纯化大豆PC的工艺,选择的最佳大孔离子交换树脂为S大孔离子交换树脂,确定的最佳条件为:进样浓度3 mg/mL(w/v)、吸附流速1 mL/min、洗脱剂为95%乙醇、洗脱流速1 mL/min。所得产物为浅黄色粉末PC(纯度为94.02%,wt%),得率为80.74%。研究了S大孔离子交换树脂吸附PC的规律。结果表明,吸附动态符合非均相未反应核收缩模型,吸附速率由PC通过已吸附层的孔内扩散控制,吸附等温线为优惠型吸附等温线,与Langmiur方程吻合,吸附过程在240 min达到平衡,吸附反应为放热反应,温度升高不利于S大孔离子交换树脂吸附PC。 磷脂复合物技术可赋予极性分子脂溶性,提高其细胞吸收效率,在改善Vc生物利用率方面具有潜在应用价值。研究了Vc-PC的制备方法及理化性质。以无水乙醇为反应溶剂,氯仿为分离溶剂。最佳反应工艺条件为Vc与PC摩尔比1:1,反应时间为3 h,反应温度为50℃,Vc浓度为0.1 mg/mL。用红外光谱分析、原子力显微镜检测、差示扫描量热法分析了产物的理化性质,结果表明,PC与Vc以非共价作用力形成复合物,无新化合物产生,该复合物在非质子溶剂中具有良好溶解性。提取小鼠腹腔巨噬细胞,用脂多糖诱导氧化应激,分别用不同浓度Vc和Vc-PC进行处理,测定培养液的NO、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和细胞内Vc、诱导性NO合成酶(iNOS)。结果表明,高剂量Vc不能抑制LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞内脂质过氧化,而高剂量Vc-PC可高效进入巨噬细胞,发挥抗氧化作用。中剂量Vc-PC可能主要结合于细胞膜,而不易进入细胞浆。说明PC-Vc可通过非Vc转运体依赖的方式进入细胞,有望避开由于同葡萄糖使用同一转运通道导致的高血糖病人Vc无法补充,以及Vc浓度异常时,人体负调节因素抑制Vc进入细胞的问题。 采用多重乳状液(W/O/W)和溶剂挥发法制备载CAT的PC-SLN。最佳合成工艺条件为:将浓度为20 mg/mL的酶溶液(内水相)加入至含三棕榈酸甘油酯(TP)和PC(TP:PC=15.24%)的二氯甲烷/丙酮(1/1)(油相),油相:内水相=5:1,超声作用20 s乳化形成W/O乳状液,加入1% Poloxamer188水溶液(第二相)中,W/O乳状液:第二相=1:4,超声作用30 s乳化形成W/O/W型乳状液,低压旋转蒸发、冷冻离心。所得CAT-SLN为球型,没有粘连,粒径大小较一致,Z电位为-37.1 mV,多分散系数小于3。CAT主要分布于SLN的W/O脂质核的内部,在溶液中可缓慢释放,包裹入SLN后CAT结构没有改变,SLN内CAT可有效抵抗蛋白酶的酶解作用。 本研究可为开发新型高效自由基清除剂类功能性食品提供理论和实践参考,有助于拓宽自由基清除剂类食品功能因子材料,改善抗氧化剂在预防慢性疾病方面的应用效率。