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《江南大学》 2012年
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基因组改组技术选育高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌

张坤坤  
【摘要】:琥珀酸,做为一种重要的C4平台化合物,广泛应用于医药、食品、可降解塑料和化学工业。发酵法生产琥珀酸具有低碳、清洁环保的特点,符合可持续发展的要求。本文以实验室保藏的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3-21为出发菌株,采用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的筛选模式,用吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变,得到基因组改组出发菌库,继而通过3轮基因组改组,获得产量提高41.8%的高产改组菌F3-Ⅱ-3-F(编号F3-ZK),并对其发酵代谢特性进行了分析。为琥珀酸高产菌株的选育提供了一种有效方法。论文具体结果如下: 分别用吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变A. succinogenes F3-21,得到1056个单菌落;这些单菌经过“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”获得11株琥珀酸产量高于出发菌株的突变株(Ⅲ-9-H、Ⅳ-7-A、Ⅳ-7-C、Ⅴ-12-B、Ⅵ-10-C、Ⅶ-11-H、Ⅷ-10-H、Ⅸ-2-C、Ⅹ-8-E、Ⅺ-8-B和Ⅻ-7-B),其平均摇瓶产琥珀酸较F3-21提高了13.9%。以该11株突变菌株为出发菌库,进行第一轮基因组改组,得到4株F1代高产改组菌(F1-Ⅰ-3-F、F1-Ⅱ-7-B、F1-Ⅲ-2-E和F1-Ⅳ-9-D),其平均摇瓶产琥珀酸较F3-21提高了20.2%,以F1代改组菌为母本进行第二轮改组,筛选得到了4株F2代高产改组菌(F2-Ⅰ-5-B、F2-Ⅱ-5-H、F2-Ⅲ-6-D和F2-Ⅲ-10-F),其平均摇瓶产琥珀酸较F3-21提高了32.9%;再以F2代改组菌为母本进行第三轮改组,结果筛选得到3株F3代高产改组菌(F3-Ⅰ-9-C、F3-Ⅱ-3-F、F3-Ⅱ-10-D),平均摇瓶产琥珀酸较F3-21提高了45.7%,其中F3-Ⅱ-3-F摇瓶产琥珀酸达到38.9 g/L,比F3-21提高了47.6%。且F3-Ⅱ-3-F传代10次,厌氧瓶产酸稳定。 在5 L搅拌发酵罐上,对各轮改组中产量最高的菌株(F1-Ⅳ-9-D、F2-Ⅲ-6-D和F3-Ⅱ-3-F)进行发酵产酸试验,其产琥珀酸水平分别为:F1-Ⅳ-9-D补料分批发酵72 h,产琥珀酸酸88.5 g/L,生产强度1.23 g/(L·h),糖酸转化率0.67 g/g;F2-Ⅲ-6-D补料分批发酵48 h,产琥珀酸87.3 g/L,生产强度1.82 g/(L·h),糖酸转化率0.71 g/g;F3-Ⅱ-3-F补料分批发酵48 h,产琥珀酸95.6 g/L,生产强度1.99 g/(L·h),糖酸转化率0.71 g/g。F3-Ⅱ-3-F较F3-21琥珀酸产量提高41.8%,生产强度提高111.7%,糖酸转化率提高9.2%。 对改组菌F3-Ⅱ-3-F和原始菌F3-21的葡萄糖代谢通量及代谢途径关键酶活性初步分析表明:F3-Ⅱ-3-F流向琥珀酸的代谢流量比F3-21提高31.6%,流向主要副产物乙酸的代谢流量比F3-21降低67.8%;F3-Ⅱ-3-F中己糖激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的比酶活比F3-21分别提高了15.4%和48.5%;丙酮酸激酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰基酶的比酶活比F3-21分别降低了21.7%、14.9%和6.2%,反映出F3-Ⅱ-3-F高产可能与这些酶活性的改变有关。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ921

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【参考文献】
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