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《江南大学》 2012年
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枯草芽孢杆菌发酵花生粕制备抗氧化肽的研究

张友维  
【摘要】:花生(Arachis Hypogaea L.)是豆科蝶形花亚科落花生属作物,属一年生草本植物,在世界各地均有种植。我国是一个花生生产大国,花生年产量在1400万吨以上,其中约有700万吨花生用于食用油的生产,产出约350万吨的花生粕。花生粕蛋白含量高达40-55%,且氨基酸种类齐全,营养价值高。但由于高温压榨制油后,花生蛋白严重变性,从而使得其主要被用作于饲料或肥料,但这两种方式对花生蛋白的利用率低。我国花生粕来源丰富,以花生粕为原料进行综合开发利用具有积极的现实意义和广阔的市场前景。 本论文以高温脱脂后的花生粕为原料,采用微生物发酵法对花生粕中的蛋白进行生物降解制备具有抗氧化活性的花生短肽。研究主要涉及花生粕化学成分的分析、发酵菌种的筛选、不同发酵时间下发酵产物的抗氧化能力分析、发酵培养基成分、发酵条件的优化、花生粕抗氧化肽的分离纯化和氨基酸序列的鉴定、抗氧化肽的化学合成及抗氧化活性的验证、抗氧化肽构效关系等内容。主要研究结果如下: 论文首先对花生粕发酵菌种进行了筛选,以发酵液中多肽含量,发酵产物对DPPH自由基、超氧自由基的清除力以及发酵产物的还原力为指标,从枯草芽孢杆菌CICC20029、CICC20001、CICC20002,地衣芽孢杆菌CICC20033、CICC23631和CICC20004等6株菌中选择发酵花生粕的适宜菌种。结果表明枯草芽孢杆菌CICC20001的各个指标均高于其它几个菌株,发酵液中多肽含量为4.92mg/ml,发酵产物对DPPH自由基的清除力为54.58%,对超氧阴离子自由基清除力为25.12%,发酵产物的还原力为30.8%,最终确定枯草芽孢杆菌CICC20001作为发酵菌种。 采用8种体外抗氧化能力评价体系分别考察了枯草芽孢杆菌CICC20001在发酵时间为48h、72h、96h、120h、144h的发酵产物的体外抗氧化活性。发酵时间为96h的发酵产物具有较好的DPPH自由基、超氧阴离子自由基、ABTS·+清除力和还原能力,清除效果分别为72.18%、28.15%、64.23%和35.77%,同时还能有效抑制亚油酸自氧化、过氧化氢诱导的红细胞溶血现象和肝细胞中脂质过氧化产物丙二醛的生成,抑制效果分别为60.73%、64.28%和61.05%;而发酵时间为120h的发酵产物具有较好的金属离子螯合能力,对Fe~(2+)的螯合效果为70.18%。 以发酵产物的DPPH自由基清除率为指标,采用Design-Expert软件Box-Behnken程序中的响应面(response surface method, RSM)功能对枯草芽孢杆菌20001发酵花生粕的培养基组成和发酵条件进行优化,得出枯草芽孢杆菌20001发酵花生粕的最优条件为,花生粕51.39g/L,葡萄糖5.27g/L,KH_2PO_43.56g/L,发酵时间94.14h,起始pH8.06,发酵温度36.38℃,接种量2.81%,在此条件下,发酵产物对DPPH自由基清除率理论预测值为79.40%,三次验证试验的平均值为80.06%,与理论值非常接近,此条件下制备的发酵产物的水解度为21.41%。 连续采用DA201-C型大孔树脂、Pall超滤装置、AKTA凝胶过滤色谱和反向高效液相色谱对优化条件下制备的花生肽进行分离纯化,每一步的纯化过程均选择DPPH自由基清除活力高的组分作为下一步分离纯化的对象。在经半制备反相高效液相色谱法纯化后,得到了两个抗氧化活性较高的抗氧化肽(F2c和F2e)。使用氨基酸自动分析仪对两个抗氧化肽的氨基酸组成进行分析,之后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flightmass spectrometry, MALDI-TOF-MS)对这两个抗氧化肽进行分子量测定和氨基酸序列鉴定,推测出F2c和F2e的分子量分别为930Da和639Da。结合氨基酸组成分析的结果,推断出这两个抗氧化肽的氨基酸序列分别为Leu-Ser-Val-Cys-Phe-Cys-Phe-Leu (LSVCFCFL)和Phe-Thr-Pro-Glu-Phe(FTPEF)。 为了验证纯化得到的抗氧化肽的抗氧化活性,选择肽段LSVCFCFL进行固相合成,测定了合成肽段LSVCFCFL各项抗氧化活性。结果发现,在0-0.6mg/mL的范围内,其对O_2~(·-)的清除效果与Vc相近,并且还具有较好的DPPH·清除力。其对几种自由基的清除效果大小依次为:DPPHABTS~(·+) O_2~(·-)。此外,LSVCFCFL的浓度在2mg/mL时,还原力为0.624;在0.8mg/mL时,对亚油酸自氧化抑制能力达到68.5%。 最后采用Hyperchem软件对肽链FTPEF和LSVCFCFL的化学结构进行构建,通过几何构型优化得到优势构象。将优化后的肽链分子的优势构象导入Gaussian09软件,使用量子化学计算方法计算分子前线轨道能量与原子表面净电荷分布情况。结果显示抗氧化肽的抗氧化活性与分子前线轨道能极差有关,肽链分子抗氧化活性的强弱可以通过前线分子轨道能极差来表示。
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