收藏本站
《江南大学》 2013年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

小泛素样修饰物介导的纯化技术研究及其应用

李俊华  
【摘要】:目前,在医药、生物催化剂和一些新兴的技术领域中,对高纯度活性蛋白的需求正在不断增长。但是在工业上大规模回收和纯化重组蛋白是困难和昂贵的。近年来的研究发现,亲和标签是一种高效的蛋白质纯化工具,它们可以在不清楚蛋白质生化特性的情况下纯化几乎所有的蛋白质。目前,新型纯化标签技术和标签去除技术的研究是亲和纯化技术研究的重要方向。本论文针对重组蛋白亲和纯化研究中的热点和难点问题,展开了研究工作,研究了具有与泛素类似的小泛素样修饰物(SUMO)与非色谱纯化标签-离子型类弹性蛋白和色谱纯化标签-核糖体蛋白L2之间的联合使用,并最终成功开发了一种高效的亲和纯化方法,主要的研究内容和成果如下: 1.以ELP[KV7F-9]和ELP[EV7F-9]为单体,采用定向回归连接法得到不同长度的离子型类弹性蛋白基因片段,并进行基因表达,采用逆相转变循环进行纯化,测定了其在不同pH下的相转变温度变化。研究表明,阳离子或阴离子型类弹性蛋白的相转变温度随着pH的变化而变化,越接近类弹性蛋白的等电点,类弹性蛋白的相转变温度就越低,但是阴阳离子型类弹性蛋白的相转变温度却不依赖于pH值,且在理论等电点附近无相转变温度降低的现象。不同长短的类弹性蛋白会对目的蛋白的表达水平和回收率造成影响,类弹性蛋白越短,融合蛋白表达水平越高,但是相应的回收率会变低。目的蛋白N端或C端融合表达,对目的蛋白的纯化回收率和表达水平都有影响。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为目的蛋白时,N端融合要比C端融合具有更高的表达量,但是两者的纯化回收率都比较低。以硫氧还蛋白(Trx)作为目的蛋白时,N端融合要比C端融合时具有更高的表达量和纯化回收率。小泛素样修饰物(SUMO)融合对目的蛋白的纯化回收率和表达水平都有提高作用,但是,融合有SUMO的类弹性蛋白不易发生相转变,发生相转变后热离心沉淀效果较差。 2.根据核糖体蛋白L2及其截短多肽在石英粉上的吸附原理,本研究中筛选了几种含硅材料和金属材料,最终筛选得到硅藻土助滤剂STD是最佳的亲和吸附材料。本研究定量和定性分析了L2(1-273)和L2(1-60,203-273)作为纯化标签时在表达性能与纯化性能上的差异,最终确定采用硅藻土助滤剂STD为亲和吸附剂和采用L2(1-60,203-273)作为纯化标签取代L2(1-273)用于重组蛋白的纯化。 3.L2(203-273)要比L2(1-60,203-273)具有更高等电点和高碱性氨基酸比例,通过对比研究这两个碱性多肽在硅藻土的吸附特性的研究,最终确定L2(203-273)为核糖体蛋白L2的吸附结合域。根据同样的原理,比较研究了L2(252-273)和L2(237-273)碱性多肽标签在吸附剂上吸附特性,研究表明:硅藻土对L2(203-273)或L2(252-273)融合蛋白具有比L2(1-60,203-273)或L2(237-273)融合蛋白更大的吸附容量和更快的吸附速率,说明多肽表面碱性氨基酸的暴露性决定了碱性多肽标签与吸附剂之间静电吸附吸附力的强弱。pH会影响L2(252-273)融合蛋白对硅藻土和羧甲基磁性纳米离子的吸附能力,等电点较低的吸附材料要比等电点较高的吸附材料更加不易受pH的影响。吸附动力学和吸附等温线研究表明,L2(252-273)融合蛋白在等电点更低的硅藻土进行吸附时,吸附速率更快,但是L2(252-273)融合蛋白在磁性纳米粒子上的吸附容量要远大于在硅藻土上的吸附量。采用L2(252-273)-SUMO融合标签纯化技术应用于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)纯化时,能得到纯度和回收率都大于的90%的EGFP。 4.由于离子交换树脂具有较好的机械稳定性,所以L2(252-273)-SUMO融合标签纯化技术可以采用吸附,清洗和酶切这一步骤简单,耗时短的纯化方法,而无需采用吸附,清洗,洗脱,酶切和吸附纯化这一复杂的纯化方法。L2(252-273)-SUMO融合标签技术以普通的离子交换树脂为吸附介质时可以用于重组过氧化氢酶的纯化,研究表明:采用该亲和纯化技术纯化过氧化氢酶时,能获得30.5倍的纯化倍数,48,227.2U/mg酶蛋白的比酶活和74.5%的活性回收率。纯化回收率大于大多数先前报道的采用其它纯化技术进行纯化的过氧化氢酶的回收率,说明本研究中的纯化技术具有一定的先进性。采用大肠杆菌重组表达的枯草芽孢杆菌过氧化氢酶的酶学性质与从非重组枯草芽孢杆菌中纯化出来的过氧化氢酶非常相近,但是由于大肠杆菌中内源性血红素合成量的不足,导致重组酶比酶活变低。 5.SUMO蛋白酶的基因编码序列中有较多的稀有密码子,采用稀有密码子强化的大肠杆菌RosettaTM(DE3)表达宿主能显著的提高重组SUMO蛋白酶的表达水平。带聚赖氨酸标签的SUMO蛋白酶要比带L2(1-60,203-273)标签的SUMO蛋白酶在相同终蛋白酶浓度下具有更好的酶切效果,但是在等摩尔浓度下两者的酶切能力相近,说明L2(1-60,203-273) N端融合时与C端融合10聚赖氨酸标签对SUMO蛋白酶的比酶活影响是相近的。采用普通的阳离子交换树脂和羧甲基磁性纳米粒子都能较好的纯化带聚赖氨酸标签的SUMO蛋白酶(Ulp1-K10),但是Ulp-K10在羧甲基磁性纳米粒子和阳离子交换树脂Amberlite Cobalamion上的吸附载量分别为211.4和36.8mg/g吸附剂。采用羧甲基磁性纳米粒子时也能纯化得到纯度较高的C端融合10聚赖氨酸标签的SUMO蛋白酶。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:TS201.2

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 张学斌;邓惠玲;胡晓翠;刘丽华;刘杏芹;;硅藻土多孔陶瓷的耐蚀性及酸/碱处理研究[J];中国非金属矿工业导刊;2006年05期
2 刑颖;;纳米二氧化硅水悬浮液的稳定性研究[J];涂料工业;2006年08期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 冯秀萍;重组人胸腺素β16的表达、纯化和胸腺素β16的应用研究[D];吉林大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 骆文隽;啤酒生产中硅藻土泥再生利用的研究[D];吉林大学;2007年
2 郭晓翔;固定化金属亲和磁性纳米粒子的制备及其纯化组氨酸标签蛋白质的研究[D];四川农业大学;2009年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 左雪芹;徐首红;刘洪来;;温敏性异丙基丙烯酰胺-二氧化硅透明质酸核壳型杂化微凝胶的合成和体积相变行为[J];功能高分子学报;2010年03期
2 许雪峰;马冰迅;黄亦申;彭伟;;利用复合磨粒抛光液的硅片化学机械抛光[J];光学精密工程;2009年07期
3 吴建锋;冷光辉;张明雷;徐晓虹;刘家元;;用Bayer法赤泥制备的多孔陶瓷滤料的结构与性能[J];硅酸盐学报;2008年12期
4 李维杰;周新丽;刘宝林;吕福扣;;纳米颗粒在低温保护剂中分散性研究[J];低温与超导;2013年06期
5 王力臻;程苏;谷书华;高海丽;;SiO_2胶体电解液分散稳定性研究[J];蓄电池;2013年03期
6 赵仲麟;袁超;金显春;苏同福;李聪;马斌强;;化学生物学课程的教学探索[J];江西农业学报;2011年07期
7 李燕;何培新;王楠;苏同福;马斌强;袁超;赵仲麟;;生物化学实验教学中开展创新性实验的探讨[J];江西农业学报;2012年02期
8 赵仲麟;马鑫;林敏;平淑珍;;内含肽介导的蛋白质环化研究进展[J];中国农业科技导报;2009年03期
9 赵仲麟;马鑫;李燕;李淑英;袁超;;基于内含肽技术的生物传感器[J];中国农业科技导报;2012年03期
10 赵仲麟;谷小青;李燕;赵玉成;马斌强;卢琳;袁超;;内含肽介导的蛋白质相互作用研究[J];江西科学;2013年03期
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 田立朋;单质硅粉氧化法制备二氧化硅溶胶及其应用特性研究[D];山东科技大学;2010年
2 宋晓宏;毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)cDNA文库构建及抗旱相关基因克隆与分析[D];东北林业大学;2011年
3 曾化伟;Serratia marcescens SYBC 08的筛选、鉴定及其发酵产过氧化氢酶的研究[D];江南大学;2011年
4 王伟;南极海洋微生物N2a鉴定、系统学及一种低温过氧化氢酶BNC纯化与性质研究[D];中国海洋大学;2008年
5 陈志华;转光剂的合成及其在纺织抗紫外中的应用研究[D];苏州大学;2012年
6 刘孝菊;成纤维细胞生长因子23及其拮抗剂蛋白的基因克隆、表达与生物学活性研究[D];吉林大学;2012年
7 吴学文;基于羟基磷灰石的纳米基因载体的改良及其内耳基因转染的实验研究[D];中南大学;2012年
8 刘华斌;纳米氧化物颗粒的表面改性及其应用研究[D];湖南大学;2012年
9 李丹;机械活化黄铁矿粉体在不同介质中的界面行为研究[D];中南大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 徐江;回收硅藻土用于啤酒过滤的研究[D];吉林大学;2011年
2 黄禹峰;少、壮、老不同年龄段肾阳虚体质基因表达谱的异同研究[D];成都中医药大学;2011年
3 何剑敏;导流式悬浮液加工机理及工艺研究[D];浙江工业大学;2012年
4 丁治英;机械球磨黄铁矿在非水环境中的界面行为研究[D];中南大学;2007年
5 杨卉;纳米粉体对棉和真丝织物的防紫外功能整理[D];苏州大学;2007年
6 张明雷;利用固体废弃物制备系列多孔陶瓷滤料[D];武汉理工大学;2008年
7 陈勇臻;SiC单晶抛光片的制备与表征[D];西安理工大学;2008年
8 张咏春;甜味蛋白Brazzein在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达研究[D];复旦大学;2008年
9 王海云;纳米载银二氧化钛整理棉织物的工艺及其抗菌性能研究[D];苏州大学;2009年
10 张晓光;高效表达重组HIV-1膜蛋白gp41及其在尿液检测中的应用[D];中国协和医科大学;2008年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王雪峰,沈颂东,迮玉官,杨龙寿,陈天,张锦云;大蒜超氧化物歧化酶的分离纯化及其性质的研究[J];安徽农业科学;2001年03期
2 钟赛意,汤国辉,王善荣;功率超声波在农产品加工中应用的研究进展[J];安徽农业科学;2005年08期
3 郑达敏,傅吉全;纳米ZnO在水体系中的分散研究[J];北京服装学院学报;2002年01期
4 吴樱,黄鹤,周加文,甘一如;利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化[J];吉林大学学报(医学版);2004年06期
5 张培因;王燕媚;卫红飞;王爱丽;于永利;王丽颖;;金属鳌合亲和层析填料的制备及其在重组六聚组氨酸融合蛋白中的应用[J];吉林大学学报(医学版);2008年02期
6 吴燕;伍素华;罗向东;苏踊跃;陈晓玲;陈渝;;重组溶葡萄球菌蛋白的原核表达、纯化及生物学活性研究[J];第三军医大学学报;2007年11期
7 王宗霞;曾路;王小波;严春杰;;硅藻土在扫描电镜下的微观形貌[J];电子显微学报;2006年S1期
8 王泽民,王孝霞,马小凡,赵宁,赵其明,王志来,赵海英;硅藻土-珍珠岩复合助滤剂[J];非金属矿;1994年01期
9 李蓉,邸泽梅,陈国亮;金属螯合亲和色谱中固定金属与蛋白质的作用[J];分析化学;2002年05期
10 刘尚义,刘秀文,蔡耘,宋海峰,应万涛,朱宝珍,李蕾,汤仲明,钱小红;亲和层析结合生物质谱技术分析鉴定猕猴血清中的重组人内皮抑制素[J];分析化学;2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 张立德;;国内外纳米材料与纳米结构研究的最新进展[A];第四届中国功能材料及其应用学术会议论文集[C];2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 黄烁;金磁微粒的制备及其对葡萄糖氧化酶的固定化研究[D];四川农业大学;2008年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 周利民;王一平;黄群武;刘峙嵘;;磁性羧甲基化壳聚糖纳米粒子的制备与表征[J];高分子材料科学与工程;2008年08期
2 高会玲;李建平;;磁性无机-生物复合粒子敏感膜新型电流型免疫传感器的研究[J];分析化学;2008年12期
3 丁建芳;姜继森;;核壳结构二氧化硅/磁性纳米粒子的制备及应用[J];材料导报;2006年S2期
4 吴伟;贺全国;陈洪;;磁性纳米粒子在生物传感器中的应用研究进展[J];化学通报;2007年04期
5 王伟;吴尧;顾忠伟;;磁性纳米粒子的表面改性及其在生物医学领域的应用[J];中国材料进展;2009年01期
6 孙文通;王仕兴;张晓红;钟读波;王亚琴;祝红昆;李军明;;层层自组装修饰磁性纳米粒子及蛋白质吸附研究[J];化学学报;2011年03期
7 刘微波;陈伟;彭池方;胥传来;;磁纳米分子印迹聚合物的制备及性能[J];食品科学;2011年10期
8 李鹏;官建国;张清杰;袁润章;;导电聚合物/磁性纳米复合材料的制备及其结构与性能[J];华东理工大学学报(自然科学版);2006年10期
9 柯诗剑;计剑;;万古霉素修饰磁性纳米粒子的制备及其细菌分离功能[J];高等学校化学学报;2007年01期
10 袁永海;李建平;;磁性纳米粒子固定辣根过氧化物酶的生物传感器[J];分析化学;2007年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈帅;韦超;韩三阳;姚建林;沈理明;顾仁敖;;免疫磁性纳米粒子的循环利用[A];第十六届全国光散射学术会议论文摘要集[C];2011年
2 吴四华;何其庄;许东芳;沈敬一;施阳;颜秉圣;;羧甲基壳聚糖磁性纳米粒子的制备、表征及对Co~(2+)的吸附行为[A];上海市化学化工学会2009年度学术年会论文集[C];2009年
3 陈婷婷;邓芳;杨柳;王永凤;孙根班;杨晓晶;;磁性纳米粒子/石墨烯复合材料的制备及吸波性能[A];中国化学会第28届学术年会第8分会场摘要集[C];2012年
4 张鹏;周岚;徐海飞;代中华;郝维;曹济民;;Fe_2O_3磁性纳米粒子对小鼠日节律的影响[A];中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会论文摘要文集[C];2010年
5 熊静;青琳森;薛莹;丁立生;廖循;;HSA功能化的磁性纳米粒子对丹参的配体垂钓研究[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年
6 孟雅娟;董丽杰;熊传溪;张俊俊;陈顺;;多巴胺修饰Fe_3O_4磁性纳米粒子的研究[A];2011年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C];2011年
7 王占华;张俊虎;谢婧;李云峰;杨柏;;利用两亲性嵌段共聚物和磁性纳米粒子自组装制备磁胶束[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(上册)[C];2009年
8 石峰;Wolfgang Knoll;;单个磁性纳米粒子在水面上搬运能力的研究[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2009年
9 陈立波;张峰;杨武利;胡建华;汪长春;;具有多重环境响应性聚合物复合微囊的研究[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2009年
10 陈志强;李建平;;基于磁性纳米粒子的生物传感器研究[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前4条
1 何屹 刘霞;美开发出可远程控制的磁性纳米粒子[N];科技日报;2010年
2 李山;脊髓液替代检查手段问世[N];科技日报;2010年
3 记者 左永刚;聚合物包覆Fe3O4磁性纳米粒子 可用于印染厂污水处理[N];中国高新技术产业导报;2010年
4 王林;备受关注的纳米复合材料[N];中国有色金属报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐海飞;磁性纳米粒子跨膜转运机制及生物学效应和碳纳米管对钾通道影响的研究[D];中国协和医科大学;2010年
2 石若冰;单分散磁性纳米粒子/微球的制备、表征与生物医学应用[D];天津大学;2012年
3 马勇杰;磁性纳米粒子的细胞内吞及基因转染研究[D];上海交通大学;2012年
4 张璐;多功能磁性纳米粒子在生物医学光子学的应用[D];吉林大学;2011年
5 单志;多功能纳米磁性粒子的合成及其在细胞富集和质粒DNA纯化中的应用研究[D];四川农业大学;2010年
6 王芳斌;二茂铁—肽的生物电化学研究以及纳米磁性粒子的表面修饰[D];中南大学;2009年
7 姜春竹;微萃取技术在环境和药物样品处理中的应用[D];吉林大学;2013年
8 张绍强;含Pr超磁致伸缩材料与磁性纳米粒子的制备与性能[D];华南理工大学;2013年
9 李琳;新型磁性分子印迹纳米复合体系用于生物大分子识别的研究[D];南开大学;2009年
10 陈东;反相微乳液法制备Fe、Ni、核壳型Ni/Au纳米粒子及类水滑石纳米化合物[D];天津大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 叶益胜;外磁场下磁性纳米粒子与高分子刷共混体系的蒙特卡洛模拟[D];浙江大学;2010年
2 胡欣;利用磁性纳米粒子检测蛋清中抗生物素蛋白的方法研究[D];华中农业大学;2011年
3 朱鸿林;基于磁性纳米粒子类酶活性的农产品安全检测技术研究[D];上海交通大学;2012年
4 朱洁;环糊精修饰的磁性纳米粒子的制备及应用[D];兰州大学;2012年
5 张崇琨;6-(1,3-二氧代异吲哚啉)已酸有机配体保护法合成磁性纳米粒子及其核磁共振成像的应用[D];上海师范大学;2012年
6 周洋波;表面改性的磁性纳米粒子在药物传递中的应用研究[D];西南交通大学;2012年
7 孟姜姜;用于相邻巯基蛋白分离的磁性纳米粒子和碳酸酐酶荧光探针的设计与合成[D];华东理工大学;2013年
8 张赛;基于壳聚糖的磁性纳米粒子的制备及其应用[D];安徽大学;2013年
9 马云辉;壳聚糖磁性纳米粒子制备及固定化烟酰型辅酶Ⅰ初探[D];华侨大学;2013年
10 杨波;钴磁性纳米粒子的制备和性质研究及应用[D];扬州大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026