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胆固醇氧化酶亲和纯化及酶稳定性研究

陈亦  
【摘要】:酶的稳定性是限制酶制剂应用的重要因素,如何提高酶的稳定性是近年来酶工程研究的热点。本实验室构建一株可胞内表达胆固醇氧化酶(COD)的基因工程菌(E.coliBL21(DE3)/pET28a-COD),但是由于该酶稳定性不佳,限制了它的应用。本论文首先建立高效亲和制备胆固醇氧化酶的方法,并通过分析纯酶的失活机理,分别采用添加剂和固定化的策略提高酶的稳定性。主要研究成果为: (1)构建不同类型的亲和介质,建立高效亲和制备胆固醇氧化酶的方法。以胆固醇氧化酶辅酶FAD的结构类似物为配体,选择不同连接臂,以琼脂糖为基质,合成不同亲和介质,以2-羟基-1,3-丙二胺连接臂,2,4-六氢嘧啶-5-羧酸、7-氯咯嗪和8-氯咯嗪为亲和配体的介质获得纯度较高的酶,其中以8-氯咯嗪为配体的介质的活性回收率最高,为98.2%,该介质最大理论吸附量为82.5mg/g,解离常数为0.6μg/mL。 (2)利用凝胶电泳、荧光光谱及圆二色性光谱等方法,研究液态胆固醇氧化酶失活机理。研究表明,液态胆固醇氧化酶失活因素涉及酶分子间聚集,导致构象变化以及表达过程中未能充分结合辅基FAD。 (3)根据酶的失活机理,研究了多元醇、渗透调节物质和辅基类似物等三类保护剂对COD酶稳定性的作用。添加15%甘油的液态酶稳定性最佳,45小时后,其酶活力保留率比液态纯酶提高了58%,添加1mol/L甜菜碱的酶活力保留率提高了36.3%,而核黄素对酶分子基本无保护作用。经荧光光谱和圆二色性光谱分析,甘油和甜菜碱抑制酶分子间聚集,维持二级结构,增强了酶稳定性;在研究中,核黄素虽能与胆固醇氧化酶结合,但不能抑制酶的分子间聚集,对酶的稳定效果不佳。 (4)采用氨基及羧基载体固定胆固醇氧化酶,以提高酶分子的稳定性。研究不同类型载体的固定化参数,对比分析固定酶与游离酶的稳定性,结果表明,固定酶稳定性优于游离酶,而且羧基载体-Asp固定化酶的稳定性明显优于氨基载体-乙二胺固定化酶。


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