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《江南大学》 2013年
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大肠杆菌过量合成莽草酸的代谢工程

李明明  
【摘要】:莽草酸(shikimic acid, SA)是芳香族氨基酸、生物碱和许多手性化合物等合成的重要中间体,是一种重要的天然有机酸。近年来,随着禽流感疫情在全球的蔓延,莽草酸作为临床上唯一有效预防和治疗禽流感药物“达菲”的关键原材料而备受关注。相较于传统的从植物果实中提取的方法和化学合成的方法,微生物发酵法生产莽草酸具有生产周期短、成本低且对环境的污染少等无可比拟的优点,已逐渐成为国内外研究的热点。因为野生型大肠杆菌发酵生产莽草酸的产量极低,且有许多其他的副产物生成,所以运用代谢工程手段,通过改变芳香族氨基酸的代谢通量和代谢途径来生产莽草酸具有广阔的应用前景。 本文从野生型大肠杆菌CICIM B0013出发,根据细胞代谢网络分析,利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌B0013的莽草酸激酶基因aroL、aroK,葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键酶EIICBglc的编码基因ptsG以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因ydiB、编码厌氧途径产乙酸的关键酶乙酸激酶-磷酸转乙酰酶基因ackA-pta基因,并系统评价了基因删除对细胞的生长、葡萄糖代谢和莽草酸积累的影响。初步摇瓶发酵显示,基因累积缺失的工程菌株B0013SA5生产莽草酸的能力由原始菌检测不到提高到150mg/L。 为加强莽草酸合成途径,引导碳代谢流更多的导向莽草酸的合成,本文强化表达了催化丙酮酸到磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA基因编码)、在戊糖磷酸途径生成赤藓糖-4-磷酸(E4P)起重要作用的转酮酶A(tktA基因编码)和催化PEP和E4P生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)的DAHP合成酶(主要由定点突变的aroG*基因编码)。首先,利用定点突变技术解除了L-苯丙氨酸对DAHP合成酶编码基因aroG反馈抑制,获得aroG*基因。在此基础上,将ppsA、tktA和aroG*基因串联插入到表达载体上并导入B0013SA5细胞中,过量表达磷酸烯醇式丙酮酸合成酶和转酮酶可以增加莽草酸合成的前体PEP和E4P的浓度,它们经由aroG*等基因编码的DAHP合成酶催化进入莽草酸途径。发酵显示,本实验构建的重组菌SA5(pTH-aroG*-ppsA-tktA)生产莽草酸的能力由上述构建的基因累加突变菌株SA5的150mg/L提高到194mg/L,提高了1.29倍。 本实验在初始发酵培养基的基础上对培养基的组分及浓度进行了优化,确定了一个适合本重组菌生长及莽草酸合成的发酵培养基。重组菌SA5(pTH-aroG*-ppsA-tktA)在优化后的培养基中摇瓶发酵莽草酸产量为1207mg/L,是在初始培养基中发酵产莽草酸的6.22倍。出发菌株B0013莽草酸产量为1.6mg/L。用该发酵培养基进行上罐发酵,莽草酸的最终产量达到了14.36g/L,是摇瓶发酵的11.9倍。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:TQ921

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【参考文献】
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