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《江南大学》 2013年
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基于上转换荧光纳米探针的高灵敏微生物毒素检测方法研究

吴世嘉  
【摘要】:稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒具有长波长激发(通常是近红外光或者红外光),短波长(紫外光或者可见光)发射的特殊光学性质,可以有效的避免生物样本自发荧光对检测的干扰,对于提高检测灵敏度和准确性具有重要意义。微生物毒素污染是引发食品安全问题的重要因素,对微生物毒素的检测也是食品安全分析中的重要指标。本论文研究了稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒作为新型荧光纳米标记物在微生物毒素检测中的应用。建立了一系列灵敏、快速、可靠以及多组分同时检测的新方法,为保障食品安全提供了有利手段。 首先,通过水/溶剂热法合成了稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒,研究反应条件,得到发光性能好,形貌均匀,纳米级的上转换荧光颗粒。随后,利用硅烷化或者配体交换的方法对上转换颗粒的表面进行改性,使得材料在水相中分散性好,并且带有生物官能团,为进一步生物功能化修饰提供了条件。通过透射电镜,荧光光谱,X射线衍射,傅里叶变换红外光谱,紫外光谱等表征结果证明上转换荧光纳米颗粒的制备和修饰成功。 其次,研究上转换荧光纳米颗粒在激光诱导荧光方法中的应用。将表面经过修饰的上转换纳米颗粒连接核酸片段,磁性纳米颗粒连接核酸适配体,通过核酸杂交使得上转换纳米颗粒与磁性纳米颗粒连接,加入被测物质后由于适配体与靶物质的特异性结合导致部分上转换颗粒与磁性颗粒解离,在外界磁场分离富集的作用下得到上转换和磁性颗粒的复合物,980nm红外激光激发下得到上转换荧光发射。通过该实验设计观察目标物赭曲霉毒素A浓度与荧光信号的关系,实现了上转换荧光纳米颗粒标记-适配体识别-磁富集的激光诱导荧光检测赭曲霉毒素A的新方法,检出限为0.0001ng·mL-1。 第三,在上转换荧光纳米颗粒成功应用于单组分的激光诱导荧光检测的基础上研究了双色上转换荧光纳米颗粒标记技术。选择荧光光谱互相不重叠的两种上转换荧光纳米颗粒分别标记两种目标物质,在980nm红外激光激发下得到两组荧光发射峰,实现同时对两组目标物质进行定量检测。一方面,将两种上转换荧光纳米颗粒标记毒素人工抗体,在竞争免疫反应的模式下,成功建立了同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的新方法,检出限均为0.01ng·mL-1;另一方面,将两种上转换荧光纳米颗粒标记核酸序列,与目标核酸序列杂交识别,成功建立了同时检测两种手足口病病毒EV-71和CV-A16的新方法,检出限分别为20pmol/L和25pmol/L。本实验也为多色上转换荧光标记技术在定量分析检测中的发展打下了基础。 第四,研究上转换荧光纳米颗粒作为荧光能量供体在荧光共振能量转移中的应用。分别将上转换荧光纳米颗粒和金纳米颗粒(作为荧光能量受体)标记在分子信标两端组成荧光共振能量转移体系,此模式下结合适配体识别和磁分离富集效应检测伏马菌毒素B1,检出限为0.01ng·mL-1。随后进一步深入探索了将双色上转换纳米颗粒同时作为荧光能量供体的模式,发现利用氧化石墨烯作为荧光能量受体,能够同时淬灭多种不同发射的上转换荧光,根据这种现象我们首次提出了多重荧光共振能量转移理论,即同一种荧光能量受体同时淬灭多种荧光能量供体。基于以上设计原理将伏马菌毒素B1和赭曲霉毒素A的适配体分别与两种上转换荧光纳米颗粒连接同时作为荧光能量供体,使其吸附到氧化石墨烯表面从而荧光淬灭,实现了多重荧光共振能量转移模式下同时对伏马菌毒素B1和赭曲霉毒素A的检测,检出限分别达到0.1ng·mL-1和0.02ng·mL-1。该研究工作扩大了荧光共振能量转移的应用,寻找发射光谱可被区分的荧光材料作为荧光能量供体,多重荧光共振能量转移模式可以应用于更多组分目标物质同时检测。 第五,研究上转换荧光纳米颗粒配合激光诱导荧光检测技术中放大检测信号提高检测灵敏度的方法。除了利用磁性纳米颗粒分离富集外,还结合了一种酶催化目标物循环信号放大的方法。针对以适配体结合靶物质的识别模式,选择核酸外切酶I能够特异性的高效的酶切单链核酸适配体,从而导致本来与适配体结合的目标物质重新释放再与新的适配体结合,目标物质在检测体系中被循环利用,引起了信号的放大,提高了检测灵敏度。实验中以上转换荧光为信号检测了金黄色葡萄球菌肠毒素B,发现在核酸外切酶I的作用下灵敏度提高50倍,检出限为0.3pg·mL-1。激光诱导上转换荧光方法由于上转换荧光本身的特点其检测灵敏度非常高,结合酶催化信号放大可以进一步提高灵敏度,解决超痕量毒素难以被检测的问题。 总之,本论文制备了稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒这一新型的荧光材料作为荧光标记物,利用其特殊的光学性质,配合以激光诱导荧光、荧光共振能量转移、适配体识别、免疫识别、分子杂交、磁分离富集、酶催化放大等等技术手段,构建了一系列新颖的、灵敏的、特异性的、稳定的、实用的分析方法用于食品中微生物毒素单一组分或多组分的同时检测,为保障食品安全提供了有力的技术支持。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:TS207.4

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【参考文献】
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【共引文献】
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