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菊糖果糖转移酶晶体结构及超高压对其构象和功能影响

李赟高  
【摘要】:菊糖果糖转移酶(IFTase)是生物法催化底物菊糖生成新型的功能性食品配料双果糖苷III(DFAIII)的关键酶。目前,关于IFTase的研究多为野生菌的筛选,对于酶的结构了解甚少。蛋白的结构决定其功能,酶的催化功能是以酶分子高度特异性的结构为基础实现的。因此,为了更好的提升IFTase的催化水平,促进对IFTase更深入的研究,有必要从分子水平上对IFTase的结构进行深入的探讨。对IFTase结构的研究,不仅有助于加深对IFTase催化机理以及构效关系的理解,也有利于为以后IFTase理性设计、改造修饰提供理论基础。本论文制备了IFTase以及IFTase-蔗果五糖复合物晶体,并对其空间结构进行了分析;其次在此基础上,利用超高压技术诱导IFTase构象发生变化,调控IFTase酶活、热稳定性等相关酶学性质,并探讨构效关系。主要研究内容和结果如下:(1)利用坐滴法制备了IFTase晶体。最终筛选得到的晶体生长条件为:0.2 mol/L一水合硫酸锂,Tris-HCl缓冲液(0.1 M,p H 8.5),聚乙烯乙二醇3350(25%,w/v)。晶体大小为0.4×0.3×0.2 mm。衍射最终分辨率为2.15?。IFTase每个不对称单元中含有三个基本相同的单体分子,并组成了一个三聚体。此三聚体通过每个亚基上Ser 293以及Ser 269之间两两形成的分子间氢键而稳定。IFTase单体呈锥形,主要是由β-折叠所构成。和已报道的IFTase结构不同的是,每个IFTase分子有三处位置可以和7个底物分子GF4相结合。其中,Asp 169以及Gln 216可能是GF4分子中葡萄糖单元的结合位点或者识别位点。Trp 103上苯环和另一个亚基上Pro 133之间形成了π-σ共轭键,以稳定IFTase分子及活性口袋。将IFTase中半胱氨酸突变成丙氨酸后,检测其在80℃下热稳定性,实验发现Cys 144、Cys 205、Cys 208对于IFTase热稳定性影响更为显著。(2)利用超高压技术处理IFTase酶溶液,对其构象及催化功能变化进行研究。IFTase经不同强度压力处理后发现,在最适温度60℃,200 MPa下处理15 min后,IFTase酶活略微升高13.6%。而随着处理压力强度提升,IFTase酶活逐渐降低。当处理压力为600MPa时,残余酶活仅为4.56%。此时,如果添加3 mol/L山梨糖醇能够使IFTase酶活提高3.88倍,此实验结果表明高浓度山梨糖醇能够提高IFTase在高压下的稳定性。卸压后,经低压处理后IFTase酶活具有回复性,而较高压力处理后IFTase失活不可逆。另外,在200 MPa下IFTase热稳定性显著提高。在80℃,在常压下保温25 min后,酶活仅剩余50.5%,而在200 MPa,80℃保温25 min后,酶活还能保留约70%,IFTase热失活速率常数可以降低55.9%,而失活活化能能提高1.41倍。采用圆二色谱、内源荧光光谱、荧光探针技术、分子筛、电泳、动态光散射、原子力显微镜等方法考察经不同压力处理后,IFTase构象的变化。研究发现,IFTase一级结构并没有发生明显的变化,而二级结构逐渐遭到了破坏。色氨酸的微环境变化则较为复杂。当处理压力小于200 MPa时,色氨酸微环境更趋向于疏水。此时,IFTase整体构象变化较少,某些局部区域如Loop环由于柔性较大,更易受到压力的影响。Loop环构象的变化可能会导致IFTase酶活发生变化。在较低压力下,Loop环可能更为致密有序,将进一步稳定活性口袋。这种构象变化“有利效应”抵消了压力导致的“不利效应”,从而造成酶活在低压下略微增加。而当压力进一步增大时,色氨酸和水分子更容易接触,分子表面疏水性增大,并且此时,IFTase三聚体发生解离,平均粒径下降,亚基之间的分子间氢键、不同亚基间Pro 133和Trp 103形成的π-σ共轭键发生断裂。IFTase刚性结构遭到破坏,从而造成IFTase在高压下稳定性降低,酶活丧失。而当添加山梨糖醇时,可能由于其能提供较多的氢键,从而稳定了蛋白构象。压力处理和温度处理对其构象作用机制有所不同。经200 MPa压力处理15 min后,IFTase中分子内二硫键含量增加。二硫键增多可以使IFTase热稳定性提高,但这并不是唯一因素。超高压处理后,非共价键的变化也对改善酶热稳定性起了至关重要的作用。(3)在了解IFTase经超高压处理后其构象及酶学性质变化的基础上,利用超高压技术考察IFTase催化水解菊糖反应体系,研究超高压下IFTase催化热动力学机制。研究发现,IFTase最适催化条件为:反应压力200 MPa,反应温度60℃,此时米氏常数、活化能、活化焓、活化体积最低,周转数、催化效率最高。在200 MPa下,IFTase最适反应p H为6.0,比常压下提高0.5个单位。1.5 mol/L的Na Cl能进一步加快IFTase在高压下的催化速度,而1.5 mol/L的Na NO3却起着相反的效果。


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