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《江南大学》 2014年
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枯草芽孢杆菌氨肽酶分泌表达、分子改造及生理功能研究

高新星  
【摘要】:氨肽酶(Aminopeptidases,简称APs,EC3.4.11)是一类能从蛋白质和多肽N端选择性切除氨基酸残基的外切蛋白酶,在食品、医药、化工行业有着广阔的市场前景。目前商品化的氨肽酶主要是利用野生菌种进行生产,由于野生菌产酶能力较低,氨肽酶的价格相对较贵。此外,氨肽酶在实际应用过程中的水解效果主要受到自身底物特异性和稳定性的影响。因此,利用基因工程手段实现氨肽酶的高效分泌表达和底物特异性、稳定性的改造能有效降低氨肽酶的生产成本,增强氨肽酶的应用效果,这对于提高氨肽酶的产品竞争力有着重要意义。 本课题组从腐乳中筛选到的一株野生菌株Bacillus subtilis Zj016,其所产胞外氨肽酶(BSAP)具有较好的应用潜力。本论文从野生菌中克隆出目的基因并在B. subtilis表达系统中实现了高效分泌表达,随后对重组BSAP的酶学性质、底物特异性改造、稳定性改造以及生理功能进行了详细的研究,主要内容如下: (1)BSAP基因克隆及分泌表达的研究。BSAP编码基因长度为1368bp,目的蛋白由455个aa组成,N端含有一个31个aa长度的信号肽。BSAP与来源于B. subtilis168的ywaD基因编码的蛋白具有高度同源性,仅有四个氨基酸不同。比较目的基因在E. coli和B. subtilis蛋白表达系统的表达水平,结果显示在E. coli中BSAP未能利用自身信号肽分泌至胞外且酶活较低,而在重组菌B. subtilis (PMA-BSAP)中BSAP利用自身信号肽实现了分泌表达,胞外酶活达到52.4±2.04U mL-1,是野生菌种产酶能力的18倍,是大肠杆菌重组菌E. coli (pET-BSAP)产酶能力的9倍左右。酶学性质表征结果显示纯酶最适反应温度和pH分为50℃和8.5,纯酶在低于60℃及pH7.5-9.0的环境中较为稳定。除了Co2+之外,其它不同的二价金属离子对重组BSAP都有不同程度的抑制作用,其中以Zn2+和Ni2+的抑制作用较强烈。重组BSAP对具有较大脂肪族侧链的疏水性氨基酸(Leu)以及碱性氨基酸(Arg和Lys)的催化能力最强,但不能催化侧链基团较大的芳香族氨基酸(Phe和Pro)和酸性氨基酸(Glu和Asp)。经产酶条件优化后,重组菌B. subtilis(PMA-BSAP)在摇瓶中产酶能力达到137U mL-1,是未优化前产量的2.6倍。基于摇瓶发酵条件探索发酵产酶的放大实验,在15L发酵罐上完成了其发酵产酶过程,产酶能力达到摇瓶发酵水平。 (2)BSAP酶分子底物特异性改造的研究。基于同源建模和底物对接技术实现了BSAP酶分子与底物分子Bestatin的对接,分析酶分子底物结合区域与底物的相互作用并确定了四个与底物有直接作用的氨基酸位点(Leu370、Asn385、Ile387、Val396)。采用饱和突变和底物特异性筛选技术筛选出五个底物特异性有明显变化的突变体,并对突变体底物特异性的改变机理进行了探讨。比较不同底物特异性BSAP的应用效果发现,利用不同底物特异性BSAP协同水解大豆蛋白时展现出最高的水解能力,水解度是野生型BSAP单独水解时的1.26倍。 (3)BSAP酶分子稳定性改造的研究。利用分子动力学模拟技术分析BSAP结构,发现其结构中含有一个热不稳定性结构域(PAdomain),删除该结构域能够有效地提高酶分子的结构稳定性。热稳定性实验和胰蛋白酶酶解实验结果显示,删除PAdomain后的突变体BSAP-ΔPA比BSAP展现出更好的温度稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力。在催化能力方面,分别以aminoacyl-pNA和Peptide A(12aa)为底物测定BSAP和BSAP-ΔPA催化常数,结果显示删除PAdomain不会影响酶分子对小分子底物的催化活性和底物特异性,但大大提高了酶分子对大分子多肽的催化能力。大豆蛋白水解实验结果显示BSAP-ΔPA较野生型BSAP展现出更好的水解能力。 (4)BSAP生理功能的研究。基于Xer/dif重组系统成功敲除B. subtilis168基因组中ywaD基因以及用ywaD-ΔPA替换ywaD基因,构建了两种突变菌株BS-AP-K和BS-AP-R。通过比较了野生型、BS-AP-K、BS-AP-R三种菌株在不同培养基以及不同温度下的生长情况,发现敲除氨肽酶会对菌株生长带来的不利影响,这种影响会随着培养温度的升高而更加明显。通过培养过程中添加多种游离氨基酸可以弥补氨肽酶的缺失对菌株生长带来的不利影响。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q93;Q78

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