收藏本站
《江南大学》 2014年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

D-半乳糖-6-硫酸化酶的分离纯化及κ-卡拉胶改性机理研究

秦晓娟  
【摘要】:κ-卡拉胶是从多种海洋红藻中提取的一种水溶性硫酸酯多糖,能形成硬的脆性胶,凝固性好,粘度低,工业上应用广泛,适合做果冻、固定化酶载体、药用硬胶囊等。天然提取的κ-卡拉胶凝胶强度比较低,需要通过改性提高其凝胶强度。目前,国内外普遍采用高温(70~90℃)碱改性(10%以上NaOH/KOH)生产高凝胶强度κ-卡拉胶,存在胶质得率低,耗碱量大,能耗高,环境污染严重等缺点。生物技术的迅速发展,使生物酶催化成为解决工业生产中节能、环保问题的有效手段。D-半乳糖-6-硫酸化酶改性可以提高κ-卡拉胶的凝胶强度,目前关于该酶的研究比较少,并且对酶改性作用机理的研究未见报道。本课题首先从不同种类海洋红藻中筛选高活性D-半乳糖-6-硫酸化酶,通过提取分离纯化获得电泳纯硫酸化酶,对该酶的稳定性及酶学特性进行全面研究,应用该酶改性制备高凝胶性能κ-卡拉胶,并对其作用机理进行深入研究。主要结果如下: 通过筛选发现异枝麒麟菜为富含D-半乳糖-6-硫酸化酶活力的原料,酶活以μ-卡拉胶计为10.87±0.39U/g,并且92.6%硫酸化酶酶活存在于可溶性组分中,膜组分酶活回收率仅为7.4%。通过优化异枝麒麟菜硫酸化酶提取方法,分析得出了较佳提取条件为:采用液氮冷冻研磨法破碎细胞,提取溶液为50mM pH8.5Tris-HCl缓冲液(含10mM2-巯基乙醇和0.5M KCl),提取时间为6h,料液比为1:3。在此条件下,提取得到的硫酸化酶活力为6.92U/mL,蛋白质含量为0.165mg/mL。 异枝麒麟菜硫酸化酶稳定性研究表明,硫酸化酶对储存pH十分敏感,最佳保存pH为7.0,另外,硫酸化酶粗酶液中加入10mM2-巯基乙醇可以在4℃下保存7天而维持酶活基本不变。在-20℃的储存温度下,添加10%甘油(v/v)的粗硫酸化酶溶液在保存10天后,酶活力基本没变,存放20天后维持80%的残余酶活。添加5%蔗糖(w/v)的硫酸化酶经过冷冻干燥后维持98.65%的残余酶活,并且在-20℃下储存40天酶活力基本没有变化。硫酸化酶为热敏感酶,添加甘氨酸和蔗糖可以提高硫酸化酶的热稳定性,在50℃下保温6h,酶液可分别维持65%和60%的初始酶活。 添加蔗糖的冻干酶粉,经硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose6Fast Flow疏水作用层析和DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析进行分离纯化。获得的硫酸化酶在SDS-PAGE电泳图上显示为单一条带,分子量约65kDa,凝胶排阻色谱法测得的分子量约50kDa,表明异枝麒麟菜硫酸化酶是单亚基蛋白。该酶的最适反应pH为7.0,最适反应温度为40℃。对于其最适底物μ-卡拉胶,Km值为4.31mM,Vmax值为0.17mM min1。化学修饰结果表明丝氨酸、赖氨酸、半胱氨酸为硫酸化酶活性中心关键氨基酸。EDTA、SDS对该酶酶活影响不大,说明此酶是非金属离子结合酶。 采用100U/kg异枝麒麟菜硫酸化酶改性制备κ-卡拉胶,凝胶强度达到1457.4g/cm2,提高了6.78倍,并且酶法改性改善了κ-卡拉胶质构,提高了其粘度、凝固点、融点等凝胶性能。对酶改性后的κ-卡拉胶进行脱色处理,研究表明大孔阴离子交换树脂D303脱色效果明显,添加量为0.16g/mL时,脱色率为90.73%,凝胶强度为1803.7g/cm2。作为对比研究,对传统碱改性工艺进行优化,较佳工艺条件为:乙醇浓度为20%、碱浓度为3%、改性时间为2h、改性温度为75℃。通过对比发现,酶法改性制备得到的κ-卡拉胶凝胶性能优于碱改性κ-卡拉胶,并且在环境保护方面有明显优势,因此,酶法改性可以替代传统碱改性工艺制备高凝胶性能κ-卡拉胶。 红外吸收光谱和1H/13C核磁共振图谱分析得出,海南异枝麒麟菜卡拉胶以κ-卡拉胶为主,同时还有少量ι-卡拉胶和β-卡拉胶。通过对D-半乳糖-6-硫酸化酶改性作用机理的研究表明,酶法改性可以将μ-卡拉胶半乳糖残基上的C-6硫酸酯基脱除转变成κ-卡拉胶中的3,6-内醚键桥,使其构象转化成螺旋亲和型,从而使κ-卡拉胶分子间相互交联增多,形成更加致密和有序的蜂窝状网络结构,进而提高κ-卡拉胶凝胶强度。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:TS201.25

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张乐华;王元兰;李忠海;;卡拉胶的结构·性能·生产及其在饮料工业中的应用[J];安徽农业科学;2008年07期
2 杜伏玲;郑敦胜;阮继良;刘美华;;卡拉胶/淀粉共混膜的制备与性能研究[J];包装工程;2008年08期
3 卞雪;曹龙奎;;马铃薯薯渣制备可食性内包装膜技术研究[J];包装工程;2010年01期
4 华汉峰;一种用途广泛的海藻胶——卡拉胶[J];水产科学;1990年01期
5 何晖;刘宝林;华泽钊;李川;吴正贞;沈敏;陈颖;;甘油对冷冻干燥保存红细胞抗氧化酶活性的影响[J];低温工程;2006年03期
6 陈炅然,胡庭俊;硫酸多糖抗病毒作用研究进展[J];动物医学进展;2005年04期
7 夏菊花;卡拉胶的特性与其在食品工业中的应用[J];化学教育;2005年09期
8 黄家康;蔡鹰;李思东;杨磊;;沙菜卡拉胶漂白工艺研究[J];广东化工;2009年04期
9 孟凡玲,罗亮,宁辉,左榘;κ-卡拉胶研究进展[J];高分子通报;2003年05期
10 徐志丽,吴晖;卡拉胶的流变性能[J];广州食品工业科技;2004年03期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 高路;紫甘薯多酚氧化酶和β-淀粉酶酶学特性的研究[D];沈阳农业大学;2008年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 彭少方,张昭;化学还原法制备纳米金属粉的几点考虑[J];四川有色金属;2003年02期
2 沈荣,郜洪文,郑立新;间苯二酚蓝在溴化十六烷基三甲铵上Langmuir吸附研究[J];安徽大学学报(自然科学版);2002年04期
3 陈忠祥,蒋伟锋;淀粉/聚乙烯醇共混胶体系相稳定性研究[J];安徽化工;2003年03期
4 杨凤霞;刘其丽;毕磊;;纳米氧化锌的应用综述[J];安徽化工;2006年01期
5 何明海;谢慧明;张文成;;溶剂浸提番茄红素的工艺参数优选[J];安徽化工;2007年04期
6 林森;复合纤维素酶在酒精生产中的应用研究[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2005年03期
7 张莉;陈乃富;;多酚氧化酶的酶学性质及其应用研究[J];安徽农学通报;2006年12期
8 吴文杰;蔡建秀;葛清秀;吴文林;;紫菜和海带浸提液对作物幼苗生长及生物量的效应[J];安徽农学通报;2007年02期
9 张帅;黄志明;梁巧荣;李达兴;;文庆鲤酶解蛋白(EAP)的制备[J];安徽农业科学;2006年13期
10 王艳;张自立;;镧对小麦矿质元素N吸收及相关酶活性的影响[J];安徽农业科学;2006年15期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张钟;张志海;;黑糯玉米芯色素(BGCP)的抗氧化活性研究[A];食品安全的理论与实践——安徽食品安全博士科技论坛论文集[C];2005年
2 陈小立;阎克路;赵择卿;;纳米吸波材料在人体防护中的现状及发展方向[A];'2001功能性纺织品及纳米技术应用研讨会论文集[C];2001年
3 商世广;王进美;;纳米抗紫外织物整理研究[A];第四届功能性纺织品及纳米技术研讨会论文集[C];2004年
4 谢秀英;刘建学;白崇仁;董铁有;;高水分农副产品物料比热的研究[A];中国机械工程学会包装与食品工程分会第三届学术年会论文集[C];1993年
5 陈颖;;G915黑曲霉生产果胶酶动力学研究[A];'96全国方便食品加工与包装技术交流会论文集[C];1996年
6 季祥;焦建龙;蔡禄;;产脂肪酶菌株的筛选及其固定化的研究[A];第十届中国科协年会论文集(二)[C];2008年
7 李慧琴;曾永青;;天然色素在面制食品中的应用及推广[A];“科技创新与食品产业可持续发展”学术研讨会暨2008年广东省食品学会年会论文集[C];2008年
8 丁胜华;欧仕益;;活性炭和大孔离子树脂对低聚木糖超滤液的脱色效果研究[A];“亚运食品安全与广东食品产业创新发展”学术研讨会暨2009年广东省食品学会年会论文集[C];2009年
9 罗平;邹建国;彭海龙;;凹凸棒石黏土胶体液脱除柴油机颗粒物机理研究[A];中国环境科学学会2009年学术年会论文集(第二卷)[C];2009年
10 马世昱;严成钊;袁勤生;;羊栖菜中褐藻糖胶的组分分析研究[A];2004年全国生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 帅学宏;山豆根多糖提取工艺及免疫学活性研究[D];甘肃农业大学;2010年
2 陈士国;几种海洋动物酸性多糖的结构和活性研究[D];中国海洋大学;2010年
3 姜欣;食品体系通电加热过程温度场的模拟研究[D];华南理工大学;2010年
4 杨荣玲;酶法合成糖苷及其酯类衍生物的研究[D];华南理工大学;2010年
5 孔凡利;荔枝果肉多糖的分离纯化与结构表征及抗氧化活性研究[D];华南理工大学;2010年
6 赵佳飞;纳米流体辐射特性机理研究及其在太阳能电热联用系统中的应用研究[D];浙江大学;2009年
7 刘述忠;纳米掺锑氧化锡(ATO)粉体制备及其浆料稳定性[D];昆明理工大学;2009年
8 程文健;琼脂基微胶囊制备技术研究[D];浙江大学;2011年
9 刘杰;甜菊糖苷中莱鲍迪A苷的研究[D];江南大学;2010年
10 张月杰;刺参岩藻多糖对神经干/前体细胞的增殖作用及其机制研究[D];山东大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 李妍佳;利用海藻制备动物营养源的研究[D];浙江工业大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 崔辉梅;石国亮;安君和;;马铃薯还原糖含量测定方法的比较研究[J];安徽农业科学;2006年19期
2 贾登三 ,李成青;紫薯市场潜力大 依据用途选良种[J];北京农业;2004年06期
3 韩颖,权国波,刘秀珍,刘安,靳鹏,曹伟;再水化液因素对冰冻干燥保存后红细胞回收率的影响[J];中国输血杂志;2004年01期
4 聂柳慧;韩永生;;壳聚糖-淀粉共混薄膜的制备与研究[J];包装工程;2005年06期
5 华汉峰;一种用途广泛的海藻胶——卡拉胶[J];水产科学;1990年01期
6 孔繁东,姬德衡,孙浩,陈海涛;草莓中多酚氧化酶的研究[J];大连轻工业学院学报;2000年01期
7 李英辉;丛丽娜;朱蓓薇;;海参肠中溶菌酶的分离纯化及其酶学性质[J];大连工业大学学报;2008年03期
8 夏菊花;卡拉胶的特性与其在食品工业中的应用[J];化学教育;2005年09期
9 李敏康;钱冬明;;冻融法提取猪血纤维蛋白原[J];分析试验室;2007年04期
10 邱宏端,李志达,张蓉真,史坚,蔡明华;从高等植物中水提β-淀粉酶的研究[J];福州大学学报(自然科学版);1995年05期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 王清;马铃薯PPO活性变化规律及抗块茎损伤褐化的基因工程研究[D];甘肃农业大学;2003年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 乔庆林;卡拉胶的性质及应用[J];肉类工业;1998年11期
2 刘芳,赵谋明,彭志英;卡拉胶与其它多糖类协同作用机理的研究进展[J];食品科学;2000年04期
3 伍胜,克纳·汉素(Klckner Haensel);卡拉胶与食品中组分的反应特性和机理[J];食品科学;2000年12期
4 孙远祥;卡拉胶的应用[J];安徽科技;2000年05期
5 刘芳,沈光林,彭志英;卡拉胶的交互作用特性及其在食品工业中的应用[J];冷饮与速冻食品工业;2000年04期
6 刘芳,赵谋明,徐建祥,彭志英;不同原料卡拉胶的物性比较研究[J];华南理工大学学报(自然科学版);2001年05期
7 韩国华,李海霞,吴杨桦;菲律宾刺生麒麟菜提取ι-卡拉胶的工艺探讨[J];食品与机械;2001年03期
8 金苏;卡拉胶在乳饮料中的应用[J];中国食品工业;2001年12期
9 ;卡拉胶的制备及应用[J];明胶科学与技术;2001年04期
10 宁发子,何新益,殷七荣,张兴全;卡拉胶的特性与应用[J];食品工业;2002年03期
中国重要会议论文全文数据库 前9条
1 朱敏;张立新;;刺麒麟菜Eucheuma spinosum中ι-卡拉胶提取工艺及其性质研究[A];中国化学会第八届天然有机化学学术研讨会论文集[C];2010年
2 孔凡标;陈国庆;黄奇峰;陈超;李润;;橙汁中卡拉胶的荧光光谱检测[A];豫赣黑苏鲁五省光学(激光)学会联合学术2012年会论文摘要集[C];2012年
3 尹利众;薛志欣;公建军;夏延致;王霞;;卡拉胶纤维的阻燃性研究[A];2010年中国阻燃学术会议论文集[C];2010年
4 龚方;刘宗利;王乃强;刘海玉;杨海军;;乳制品中卡拉胶海藻多糖硫酸酯化技术研究[A];第三届中国奶业大会论文集(下册)[C];2012年
5 张立新;薛峰;范晓;赵夕龙;刘秀;;离子选择性电极法测定卡拉胶中钾含量[A];中国海洋学会海洋生物工程2005年学术年会论文集[C];2005年
6 段高飞;韩峰;于文功;;海洋细菌Cellulophaga sp.QY201产λ-卡拉胶酶发酵条件的优化[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
7 王登良;文新健;龙志荣;;卡拉胶在绿茶初制过程中的应用[A];第四届海峡两岸茶业学术研讨会论文集[C];2006年
8 王霞;薛志欣;夏延致;;卡拉胶纤维的阻燃性能研究[A];2011年中国阻燃学术年会会议论文集[C];2011年
9 李雁;吴青;朱博通;张惠君;李征;许文玲;;话梅果糕的制作[A];农业工程科技创新与建设现代农业——2005年中国农业工程学会学术年会论文集第四分册[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前8条
1 记者 侯小健;海南卡拉胶走俏国内市场[N];海南日报;2000年
2 记者 周进文 通讯员 施丽丽;我市卡拉胶出口量占全省六成七[N];石狮日报;2012年
3 浮吟梅 王林山 苏海燕;卡拉胶在食品工业中的应用[N];中国食品质量报;2010年
4 于天祥 费飞金 王轶星;嘉兴检验检疫局严格把关助卡拉胶进入北欧市场[N];中国国门时报;2011年
5 应洪舒;中科院海洋所海洋生物活性物质研究通过鉴定[N];中国医药报;2005年
6 ;芦荟果冻加工技术[N];山西科技报;2002年
7 本报记者 崔鲸涛 通讯员 姜华荣;科技催生热带产胶海藻新产业[N];中国海洋报;2012年
8 钟全斌;吃果冻小心吸进气管[N];中国质量报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 袁华茂;卡拉胶寡糖与衍生物的制备及生物活性研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2005年
2 吴娜娜;大豆油体及大豆油体—卡拉胶乳液稳定性研究[D];华南理工大学;2012年
3 刘芳;沙菜高凝胶性能卡拉胶提胶机理的研究[D];华南理工大学;2001年
4 马素;海洋细菌Cellulophaga sp.QY3ι-卡拉胶酶的研究[D];中国海洋大学;2013年
5 秦晓娟;D-半乳糖-6-硫酸化酶的分离纯化及κ-卡拉胶改性机理研究[D];江南大学;2014年
6 马悦欣;Pseudoalteromonas sp. AJ5-913的κ-卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析[D];中国海洋大学;2008年
7 胡坤;多糖对大豆分离蛋白乳浊体系特性的影响及其作用机理研究[D];华南理工大学;2003年
8 李苗苗;人体肠道微生物对琼胶与κ-卡拉胶及其寡糖的降解和利用研究[D];中国海洋大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 古铮;海洋卡拉胶降解菌Cellulophaga sp.KL-A的筛选优化及卡拉胶酶研究[D];厦门大学;2014年
2 刘哲民;κ-卡拉胶酶基因克隆表达及酶法制备卡拉胶低聚糖工艺研究[D];中国海洋大学;2014年
3 尹利众;卡拉胶纤维的制备与性能研究[D];青岛大学;2010年
4 余成艳;邻苯二甲酰基化κ-卡拉胶的合成及其生物活性[D];汕头大学;2007年
5 付永强;交联卡拉胶纤维的制备[D];青岛大学;2011年
6 孙文兵;水杨酸类药物改性低分子量κ-卡拉胶的合成与生物活性测试[D];汕头大学;2008年
7 张乐华;低浓度卡拉胶的流变特性及其复配性研究[D];中南林业科技大学;2008年
8 刘雪平;低粘度低硫酸基耳突麒麟菜卡拉胶提取方法及流变学特性研究[D];中国海洋大学;2013年
9 侯丽丽;刺麒麟菜(Eucheuma spinosum)提取ι-卡拉胶的新工艺及流变学特性研究[D];中国海洋大学;2014年
10 魏玉;κ-卡拉胶的凝胶化作用及其与魔芋胶协同作用特性研究[D];中南林业科技大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026