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《江南大学》 2016年
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乳杆菌表层蛋白的理化性质和生物学功能研究

孟珺  
【摘要】:乳杆菌是人及动物肠道内的生理性细菌,因其对宿主有良好的益生作用而被广泛应用于食品、医药行业。乳杆菌外层包裹着一种表层蛋白,可通过非共价作用连接于古生菌和细菌的细胞壁。近年来陆续有研究发现表层蛋白对乳杆菌发挥益生功能有着卓著的贡献。但并非所有乳杆菌都具有表层蛋白结构,且研究多集中于少数菌种。因此,对于丰富的乳杆菌资源,可用于研究比对的表层蛋白数据资源非常有限。本文从大量的乳杆菌资源中甄别具有表层蛋白的乳杆菌,提取表层蛋白并解析其理化性质;通过研究表层蛋白对乳杆菌表面性质、消化道耐受力、黏附性质和抑菌能力的影响,明确表层蛋白对乳杆菌的生物学贡献;最后,为深入了解乳杆菌表层蛋白的生物学功能,对不同乳杆菌表层蛋白的抑菌机制进行了进一步研究,为乳杆菌及其表层蛋白在食品、医药行业的应用提供理论基础。以已知具有表层蛋白的Lactobacillus acidophilus NCFM作为参照菌株。对30株待筛选的乳杆菌进行LiCl处理,对其提取物进行SDS-PAGE分析,发现仅6株乳杆菌的提取物有明显的表层蛋白条带,分别是L.bulgaricus fb04、L.casei fb05、L.rhamnosus fb06、L.gasseri fb07、L.gasseri fb08、L.acidophilus fb11。6种乳杆菌表层蛋白的相对分子质量均在45,000-47,000。采用透射电镜对比观察LiCl处理前后乳杆菌表层结构的变化,进一步确认了上述乳杆菌的表层结构。利用离子交换色谱对7种表层蛋白进行纯化,得到纯度较高的表层蛋白用于理化性质分析。氨基酸组成分析表明7种表层蛋白氨基酸组成相似,均含有大量的疏水性氨基酸(31%-49%),碱性氨基酸含量高于酸性氨基酸,符合文献报道的表层蛋白的一般特性。采用圆二色谱法对表层蛋白的二级结构进行解析,发现两株加氏乳杆菌、两株嗜酸乳杆菌表层蛋白二级结构的组成比例相似。但其余几株乳杆菌表层蛋白二级结构组成则差异较大。因此,推测加氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌表层蛋白的二级结构与菌株亲缘性相关。采用差示扫描量热法测定表层蛋白的热变性温度,结果表明7种表层蛋白均只有一个热变性温度。热变性温度最低的是L.bulgaricus fb04,43.14±0.82°C;最高的是L.rhamnosus fb06,72.83±0.60°C;其余5种表层蛋白的热变性温度在59-71°C之间。综合分析二级结构与热变性温度的结果,发现β-折叠比例较高的表层蛋白,其热变性温度相应较高。从表面疏水性、表面电荷、聚集能力和消化道耐受力多个方面研究了表层蛋白对乳杆菌菌体的生物学贡献。剥除表层蛋白之后,7株乳杆菌的表面疏水性、表面电荷、聚集能力和消化道耐受力均显著下降(P0.05)。在胆盐应激条件下,6株乳杆菌表层蛋白的表达量提高了1.5-2.8倍。这些结果提示表层蛋白对乳杆菌的表面性质有着积极的贡献,且有助于乳杆菌抵抗不良的生存环境。以I型、V型胶原蛋白和HT-29细胞作为肠道组织模型,研究了表层蛋白对乳杆菌黏附性质和抑菌能力的影响。失去表层蛋白后,7株乳杆菌黏附胶原蛋白和HT-29细胞的能力分别下降了37%-95%和63%-94%。乳杆菌抑制Escherichia coli和Salmonella typhimurium侵袭HT-29细胞的能力也被显著削弱。利用纯化后的表层蛋白对E.coli和S.typhimurium的黏附作用进行干预,发现7种表层蛋白均可显著减少E.coli和S.typhimurium对I型和V型胶原蛋白的黏附;还可通过排斥、竞争和替换的方式抑制E.coli和S.typhimurium对HT-29细胞的黏附,其中排斥作用效果最强。以上结果表明,表层蛋白不仅有助于乳杆菌黏附于肠道、抑制肠道致病菌侵袭,还可作为抗黏附剂,减少E.coli和S.Typhimurium对肠道组织的黏附。为了进一步揭示乳杆菌表层蛋白抑制致病菌感染的机制,研究了7种乳杆菌表层蛋白对E.coli和S.typhimurium细胞壁肽聚糖的水解酶活性。通过测定致病菌的生长曲线和菌落计数,发现7种表层蛋白中只有L.acidophilus NCFM和L.acidophilus fb11的表层蛋白可以直接抑制E.coli和S.typhimurium的生长。酶谱分析结果显示两种L.acidophilus表层蛋白可水解E.coli和S.typhimurium的细胞壁肽聚糖,推测嗜酸乳杆菌表层蛋白可能是一种肽聚糖水解酶。利用透射电镜和流式细胞术分析表层蛋白水解细胞壁肽聚糖对致病菌外表形态和生理状态的影响,发现表层蛋白的胞壁质水解酶活性可使E.coli和S.typhimurium处于细胞壁破损但胞内酶活仍较旺盛的亚致死状态。在7种表层蛋白中,这是嗜酸乳杆菌表层蛋白特有的一种抑制致病菌的机制。从细胞凋亡的角度研究了乳杆菌表层蛋白抑制致病菌感染的机制。首先通过Hoechst 33342/PI双染,在荧光显微镜下观察到L.casei fb05、L.rhamnosus fb06、L.acidophilus fb11和L.acidophilus NCFM的表层蛋白可减少E.coli和S.typhimurium导致的HT-29细胞染色质凝聚。采用流式细胞术分析Annexin V-FITC/PI双染细胞,发现以上4种表层蛋白可减少E.coli和S.typhimurium导致的HT-29细胞的早期凋亡。对细胞凋亡通路中的关键因子进行测定,结果显示4种表层蛋白可通过稳定胞内线粒体膜电位和Ca2+浓度水平,抑制Caspase-1、Caspase-9和Caspase-3的激活,从而降低E.coli和S.typhimurium引起的细胞凋亡。说明这4种乳杆菌表层蛋白可通过调控线粒体介导的凋亡通路减少肠道致病菌引起的上皮细胞的凋亡与损伤。综上所述,共筛选出7株携带表层蛋白的乳杆菌,并分析了表层蛋白的理化性质。证实了表层蛋白对乳杆菌表面性质、消化道耐受力、黏附性质和抑菌能力的积极贡献。在细胞和分子水平上,探索了不同表层蛋白的抑菌机制,为乳杆菌及其表层蛋白在健康干预领域的实际应用提供了理论支持。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TS201.3

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